Basalmembranmatrix Verkapselte Zellaggregation zur Untersuchung der Milzgewebebildung von Mäusen
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Aggregation und Verkapselung von Milzzellen in einer halbfesten Basalmembranmatrix. Basalmembranmatrix-Konstrukte können in dreidimensionalen Kulturen zur Untersuchung der Organoidentwicklung oder für In-vivo-Transplantations – und Geweberegenerationsstudien verwendet werden.
Abstract
Die Milz ist ein Immunorgan, das eine Schlüsselrolle bei der durch Blut übertragenen Immunantwort spielt. Der anatomische oder funktionelle Verlust dieses Gewebes erhöht die Anfälligkeit für schwere Blutinfektionen und Sepsis. Die Autotransplantation von Milzschnitten wurde klinisch eingesetzt, um verlorenes Gewebe zu ersetzen und die Immunfunktion wiederherzustellen. Der Mechanismus, der eine robuste und immunologisch funktionelle Milzgeweberegeneration antreibt, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Hier wollen wir eine Methode zur Aggregation und Verkapselung von Milzzellen innerhalb einer halbfesten Matrix entwickeln, um die zellulären Anforderungen für die Bildung von Milzgewebe zu untersuchen. Verkapselte Zellkonstrukte mit Basalmembranmatrix sind sowohl für die In-vitro-Gewebekultur von dreidimensionalen Organoiden als auch für die Transplantation unter der Nierenkapsel geeignet, um die in vivo-Gewebebildung direkt zu beurteilen. Durch die Manipulation der Eingangszellen für die Aggregation und Verkapselung zeigen wir, dass aus Transplantaten gewonnene PDGFRβ+MAdCAM-1-neonatale Stromazellen für die Regeneration von Milzgewebe unter Tiertransplantationsmodellen benötigt werden.
Introduction
Ein traumatischer Milzriss und das Auftreten mehrerer Milzknötchen im Körper war einer der ersten Hinweise darauf, dass Milzgewebe eine Regenerationsfähigkeit besitzt 1,2. Später wurden Milz-Autotransplantationen in die Klinik eingeführt, um Milzgewebe bei Patienten zu erhalten, die eine Notfall-Splenektomiebenötigten 3. Doch obwohl sie seit Jahrzehnten Teil der klinischen Praxis ist, ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie sich die Milz regeneriert. Tiertransplantationsmodelle haben Einblicke in mehrere Parameter der Milzregeneration und der Immunfunktion gegeben 4,5. Insbesondere experimentelle Modifikationen der Transplantatpräparationsmethode haben es ermöglicht, die Geweberegeneration auf zellulärer und molekularer Ebene genauer zu untersuchen.
Transplantationen mit ganzen Milzschnitten durchlaufen eine Phase der Massennekrose, bevor eine neue Milzstruktur wieder aufgebaut wird6. Die Anfangsphase der Transplantatnekrose deutet darauf hin, dass der Großteil des transplantierten Gewebes größtenteils aus roten und weißen Blutkörperchen besteht und für die Milzregeneration unnötig ist. Dies wurde experimentell untersucht, indem hämatopoetische Zellen aus Milztransplantaten vor der Transplantation unter die Nierenkapsel der Maus ausgeschlossen wurden. Hier wurde gezeigt, dass die Nicht-Leukozyten/Nicht-Erythrozyten-Fraktion der Milz, die Stroma- und Endothelzellen umfasst, ausreicht, um die De-novo-Gewebebildung zu induzieren7. Milzstromagewebe könnte zu einer Einzelzellsuspension weiterverarbeitet werden, was den Einsatz von Zellsortiertechnologien zur Manipulation der zellulären Transplantatzusammensetzung ermöglicht. Durch selektive Entfernung von Kandidatenzelltypen wurden zwei CD45-TER-119-Stromazellpopulationen identifiziert, die für die Transplantatentwicklung unerlässlich waren: eine endothelähnliche CD31+CD105+MAdCAM-1+-Zellpopulation und eine weiter gefasste PDGFRβ+-mesenchymale Zellpopulation8.
Der Aufbau von Transplantaten aus Milzzellen variiert in Bezug auf Stützmaterialien und Zellbeladungsprozesse. Tissue-Züchtungsmilz wurde zuvor durch Laden von Milzeinheiten auf ein Polyglykolsäure/Poly-L-Milchsäure-Polymergerüst 5,9 hergestellt. Interessanterweise konnten sich Milzstromazellen, die in einen Kollagenschwamm absorbiert wurden, nicht transplantieren, während Stromazellen, die aggregiert und über eine Kollagenschicht geladen wurden, die Milzregeneration erleichterten8. Es wurde auch gezeigt, dass die Resuspension von Milzstromazellen innerhalb einer Matrigel-Matrix die Zellaggregation unter dreidimensionalen Kulturbedingungen induziert10. Diese Methode wurde jedoch nicht für den Einsatz in Transplantationsmodellen getestet. Das übergeordnete Ziel des aktuellen Protokolls besteht darin, Milzstromazellen direkt in der Basalmembranmatrix zwangsweise zu aggregieren und einzukapseln, die anschließend in ein dreidimensionales In-vitro-Gewebekultursystem überführt oder als Vehikel für Tiermodelltransplantationen verwendet werden können (Ergänzende Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Aggregation von neonatalen Milzzellen in einem halbfesten Medium stellt eine praktikable Methode zur Erzeugung von Milzkonstrukten dar. Ähnliche Protokolle auf Basis der Basalmembranmatrix wurden verwendet, um dreidimensionale Milzkulturen zu initiieren10. Hier zeigen wir, dass Milzkonstrukte sowohl für in vitro Organoid-Kultursysteme als auch für in vivo Transplantationsmodelle geeignet sind. Bemerkenswert ist, dass die Transplantation von in vitro kultivierten M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom National Health and Medical Research Council of Australia (#GNT1078247) unterstützt.
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
References
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