Basement Membrane Matrix Ingekapselde Celaggregatie voor het onderzoeken van de vorming van miltweefsel bij muizen
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor het samenvoegen en inkapselen van miltcellen in een halfvaste basaalmembraanmatrix. Basale membraanmatrixconstructies kunnen worden gebruikt in driedimensionale kweek voor het bestuderen van de ontwikkeling van organoïden, of voor in vivo transplantatie- en weefselregeneratiestudies.
Abstract
De milt is een immuunorgaan dat een sleutelrol speelt bij door bloed overgedragen immuunresponsen. Het anatomische of functionele verlies van dit weefsel verhoogt de vatbaarheid voor ernstige bloedinfecties en sepsis. Autotransplantatie van miltplakken is klinisch gebruikt om verloren weefsel te vervangen en de immuunfunctie te herstellen. Het mechanisme dat robuuste en immunologisch functionele miltweefselregeneratie aandrijft, is echter niet volledig opgehelderd. Hier willen we een methode ontwikkelen voor het samenvoegen en inkapselen van miltcellen in een halfvaste matrix om de cellulaire vereisten voor de vorming van miltweefsel te onderzoeken. Ingekapselde celconstructies met basale membraanmatrix zijn geschikt voor zowel in vitro weefselkweek van driedimensionale organoïden als transplantatie onder het nierkapsel om de weefselvorming in vivo direct te beoordelen. Door de inputcellen te manipuleren voor aggregatie en inkapseling, tonen we aan dat graft-afgeleide PDGFRβ+MAdCAM-1– neonatale stromale cellen nodig zijn voor de regeneratie van miltweefsel onder diertransplantatiemodellen.
Introduction
Traumatische ruptuur van de milt en het verschijnen van meerdere miltknobbeltjes in het lichaam was een van de eerste aanwijzingen dat miltweefsel regeneratief vermogen had 1,2. Automatische milttransplantaties werden later in de kliniek geïntroduceerd om miltweefsel te behouden bij patiënten die een spoedsplenectomie nodig hadden3. Maar ondanks het feit dat het al tientallen jaren deel uitmaakt van de klinische praktijk, is er heel weinig bekend over hoe de milt regenereert. Diertransplantatiemodellen hebben inzicht gegeven in meerdere parameters van miltregeneratie en immuunfunctie 4,5. Met name experimentele wijzigingen in de methode voor de voorbereiding van het transplantaat hebben het mogelijk gemaakt weefselregeneratie gedetailleerder te bestuderen op cellulair en moleculair niveau.
Transplantaties waarbij hele miltplakken betrokken zijn, ondergaan een fase van massale necrose voordat een nieuwe miltstructuur wordt herbouwd6. De beginfase van transplantaatnecrose suggereert dat het grootste deel van het getransplanteerde weefsel grotendeels bestaat uit rode en witte bloedcellen en niet nodig is voor miltregeneratie. Dit werd experimenteel onderzocht door hematopoëtische cellen uit milttransplantaten uit te sluiten vóór transplantatie onder het nierkapsel van de muis. Hier bleek de niet-leukocyten/niet-erytrocytenfractie van de milt, die stromale en endotheelcellen omvat, voldoende te zijn om de novo weefselvorming te induceren7. Milt stromaal weefsel zou verder kunnen worden verwerkt tot een eencellige suspensie, waardoor het gebruik van celsorteertechnologieën mogelijk wordt om de samenstelling van cellulaire transplantaten te manipuleren. Door selectief kandidaat-celtypen te verwijderen, werden twee CD45-TER-119-stromale celpopulaties geïdentificeerd die onmisbaar waren voor de ontwikkeling van transplantaten: een endotheelachtige CD31+CD105+MAdCAM-1+ celpopulatie en een breder gedefinieerde PDGFRβ+ mesenchymale celpopulatie8.
De constructie van transplantaten uit miltcellen varieert in termen van ondersteuningsmaterialen en celbelastingsprocessen. Weefselgemanipuleerde milten zijn eerder bereid door milteenheden op een polyglycolzuur/poly-L melkzuurpolymeersteiger 5,9 te laden. Interessant is dat stromale cellen van de milt die in een collageenspons werden geabsorbeerd, er niet in slaagden om te implanteren, terwijl stromale cellen die werden geaggregeerd en over een collageenvel werden geladen,de regeneratie van de milt vergemakkelijkten. Het is ook aangetoond dat de resuspensie van stromale cellen in een Matrigel-matrix celaggregatie induceert onder driedimensionale kweekomstandigheden10. Deze methode is echter niet getest voor gebruik in transplantatiemodellen. Het algemene doel van het huidige protocol is om stromale cellen van de milt rechtstreeks in de basale membraanmatrix te aggregeren en in te kapselen, die vervolgens kunnen worden overgebracht naar een driedimensionaal in vitro weefselkweeksysteem of kunnen worden gebruikt als voertuig voor transplantaties van diermodellen (aanvullende figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
De aggregatie van neonatale miltcellen in een halfvast medium vertegenwoordigt een levensvatbare methode voor het genereren van miltconstructen. Vergelijkbare protocollen op basis van basaalmembraanmatrix zijn gebruikt om driedimensionale miltculturen te initiëren10. Hier tonen we aan dat miltconstructen even geschikt zijn voor in vitro organoïdekweeksystemen als voor in vivo transplantatiemodellen. Merk op dat de transplantatie van in vitro gekweekte miltorganoïden n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Health and Medical Research Council of Australia (#GNT1078247).
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
References
- Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
- Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
- Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863 (1989).
- Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
- Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
- Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401 (2017).
- Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
- Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408 (2019).
- . Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023)
