مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة تجميع الخلايا للتحقيق في تكوين أنسجة طحال الفئران
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكولا لتجميع خلايا الطحال وتغليفها داخل مصفوفة غشاء قاعدي شبه صلب. يمكن استخدام تركيبات مصفوفة الغشاء القاعدي في الثقافة ثلاثية الأبعاد لدراسة تطور الأعضاء ، أو لدراسات زرع الجسم الحي وتجديد الأنسجة.
Abstract
الطحال هو عضو مناعي يلعب دورا رئيسيا في الاستجابات المناعية المنقولة بالدم. يزيد الفقدان التشريحي أو الوظيفي لهذا النسيج من التعرض لالتهابات الدم الحادة والإنتان. تم استخدام الزرع التلقائي لشرائح الطحال سريريا لاستبدال الأنسجة المفقودة واستعادة وظيفة المناعة. ومع ذلك ، فإن الآلية التي تقود تجديد أنسجة الطحال القوية والوظيفية مناعيا لم يتم توضيحها بشكل كامل. هنا ، نهدف إلى تطوير طريقة لتجميع وتغليف خلايا الطحال داخل مصفوفة شبه صلبة من أجل التحقيق في المتطلبات الخلوية لتشكيل أنسجة الطحال. تكون تركيبات الخلايا المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي قابلة لكل من زراعة الأنسجة في المختبر من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد وكذلك الزرع تحت كبسولة الكلى لتقييم تكوين الأنسجة الحية مباشرة. من خلال معالجة خلايا الإدخال للتجميع والتغليف ، أثبتنا أن خلايا انسجة الأطفال حديثي الولادة المشتقة من الكسب غير المشروع PDGFRβ + MAdCAM-1- مطلوبة لتجديد أنسجة الطحال في إطار نماذج زراعة.
Introduction
كان تمزق الطحال الرضحي وظهور عقيدات طحالية متعددة في الجسم أحد المؤشرات الأولى على أن أنسجة الطحال لديها قدرة متجددة 1,2. تم إدخال عمليات زرع الطحال في وقت لاحق إلى العيادة للحفاظ على أنسجة الطحال في المرضى الذين يحتاجون إلى استئصال الطحال في حالات الطوارئ3. ومع ذلك ، على الرغم من كونها جزءا من الممارسة السريرية لعقود من الزمن ، لا يعرف سوى القليل جدا عن كيفية تجدد الطحال. قدمت نماذج زراعة نظرة ثاقبة على معايير متعددة لتجديد الطحال ووظيفة المناعة 4,5. على وجه الخصوص ، سمحت التعديلات التجريبية على طريقة تحضير الكسب غير المشروع بدراسة تجديد الأنسجة بمزيد من التفصيل على المستوى الخلوي والجزيئي.
تخضع عمليات الزرع التي تتضمن شرائح طحال كاملة لمرحلة من النخر الجماعي قبل إعادة بناء هيكل الطحال الجديد6. تشير المرحلة الأولية من نخر الكسب غير المشروع إلى أن الجزء الأكبر من الأنسجة المزروعة يتكون إلى حد كبير من خلايا الدم الحمراء والبيضاء وغير ضروري لتجديد الطحال. تم التحقيق في ذلك تجريبيا عن طريق استبعاد الخلايا المكونة للدم من ترقيع الطحال قبل الزرع تحت كبسولة الكلى الفأر. هنا ، تبين أن الجزء غير الكريات البيض / غير كريات الدم الحمراء من الطحال ، والذي يتضمن الخلايا اللحمية والبطانية ، كاف للحث على تكوين أنسجة دي نوفو 7. يمكن معالجة أنسجة انسجة الطحال بشكل أكبر في تعليق أحادي الخلية ، مما يتيح استخدام تقنيات فرز الخلايا لمعالجة تكوين الكسب غير المشروع الخلوي. من خلال إزالة أنواع الخلايا المرشحة بشكل انتقائي ، تم تحديد مجموعتين من الخلايا اللحمية CD45-TER-119 التي لا غنى عنها لتطوير الكسب غير المشروع: مجموعة خلايا CD31 + CD105 + MAdCAM-1 + تشبه البطانة ومجموعة خلايا اللحمة المتوسطة PDGFRβ + المحددة على نطاق أوسع8.
يختلف بناء الطعوم من خلايا الطحال من حيث مواد الدعم وعمليات تحميل الخلايا. تم تحضير الطحال المصمم بالأنسجة مسبقا عن طريق تحميل وحدات الطحال على سقالة بوليمر حمض اللاكتيك polyglycolic / poly-L 5,9. ومن المثير للاهتمام أن خلايا انسجة الطحال التي تم امتصاصها في إسفنجة الكولاجين فشلت في التطعيم ، في حين أن الخلايا اللحمية المجمعة والمحملة على ورقة الكولاجين سهلت تجديد الطحال8. كما ثبت أن إعادة تعليق خلايا انسجة الطحال داخل مصفوفة Matrigel تحفز تراكم الخلايا في ظل ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد10. ومع ذلك ، لم يتم اختبار هذه الطريقة لاستخدامها في نماذج الزرع. الهدف العام من البروتوكول الحالي هو تجميع وتغليف خلايا انسجة الطحال بالقوة مباشرة داخل مصفوفة الغشاء القاعدي ، والتي يمكن نقلها لاحقا إلى نظام زراعة الأنسجة ثلاثي الأبعاد في المختبر أو استخدامها كوسيلة لزراعة النماذج الحيوانية (الشكل التكميلي 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
يمثل تجميع خلايا الطحال الوليدي داخل وسط شبه صلب طريقة قابلة للتطبيق لتوليد تركيبات الطحال. تم استخدام بروتوكولات مماثلة قائمة على مصفوفة الغشاء القاعدي لبدء مزارع الطحال ثلاثية الأبعاد10. هنا ، نوضح أن تركيبات الطحال قابلة بنفس القدر لأنظمة الاستزراع العضوي في المختبر …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (#GNT1078247).
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
References
- Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
- Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
- Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863 (1989).
- Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
- Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
- Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401 (2017).
- Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
- Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408 (2019).
- . Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023)
