초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입
Summary
이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
초파리의 형질전환은 유기체 수준에서 유전자 기능을 연구하는 데 필수적인 접근 방식입니다. 배아 미세주입은 형질전환 파리의 구축을 위한 중요한 단계입니다. 미세주입에는 미세주입기, 미세조작기, 도립 현미경 및 실체 현미경을 포함한 몇 가지 유형의 장비가 필요합니다. plasmid miniprep kit로 분리한 plasmid는 microinjection에 적합합니다. 핵이 공통 세포질을 공유하는 pre-blastoderm 또는 syncytial blastoderm 단계의 배아는 미세 주입을 받습니다. 세포 여과기는 배아의 탈코리오화 과정을 용이하게 합니다. 배아의 탈응모 및 건조를 위한 최적의 시간은 실험적으로 결정해야 합니다. 배아 미세주입의 효율성을 높이려면 풀러로 준비한 바늘을 니들 그라인더로 경사지게 해야 합니다. 바늘을 가는 과정에서 바늘 끝의 모세관 효과를 피하기 위해 압력 게이지가 있는 발 공기 펌프를 사용합니다. 우리는 일상적으로 각 플라스미드에 대해 120-140개의 배아를 주입하고 플라스미드의 약 85%에 대해 적어도 하나의 형질전환 라인을 얻습니다. 이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.
Introduction
초파리 Drosophila melanogaster는 유전자 조작 및 유전자 분석에 매우 적합합니다. 형질전환 초파리는 생물학 연구에 널리 사용됩니다. 1980년대 초에 개발된 이래로 P-element transposon-mediated transgenesis는 초파리 연구에 없어서는 안 될 필수 요소였습니다1. 일부 시나리오에서는 piggyBac 및 Minos와 같은 다른 transposon이 Drosophila의 transgenesis에 사용되기도 했습니다2. 트랜스포존을 통한 전이유전자는 초파리 게놈에 무작위로 삽입되며, 위치 효과에 따라 다른 유전체 자리에서 전이유전자의 발현 수준이 달라질 수 있으므로 비교할 수 없다2. 이러한 단점은 phiC31 매개 부위 특이적 형질전환(site-specific transgenesis)에 의해 극복되었다3. 박테리오파지 phiC31 유전자는 Drosophila3의 attB와 attP 부위 사이의 염기서열 특이적 재조합을 매개하는 인테그라제를 암호화합니다. 많은 attP 도킹 사이트가 특성화되어 Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9에서 사용할 수 있습니다.
초파리에 대한 phiC31 형질전환 시스템은 파리 커뮤니티에서 널리 사용되었습니다. attP 도킹 부위 중에서, X 염색체의 attP18, 두 번째 염색체의 attP40, 세 번째 염색체의 attP2는 일반적으로 각 염색체의 전이유전자 통합에 선호되는 부위인데, 그 이유는 세 부위의 전이유전자가 낮은 수준의 기저 발현을 보이면서 유도 가능한 발현 수준이 높기 때문이다5. 그러나 최근에 van der Graaf와 동료들은 Msp300 유전자 자리에 가까운 attP40 부위와 attP40에 통합된 전이유전자가 Drosophila10에서 유충 근육 핵 클러스터링을 유발한다는 것을 발견했습니다. 또 다른 최근 연구에서 Duan과 동료들은 동형접합 attP40 염색체가 Drosophila11에서 Or47b 후각 수용체 뉴런 클래스의 정상적인 사구체 조직을 방해한다는 것을 발견했습니다. 이러한 결과는 실험을 설계하고 데이터를 해석할 때 엄격한 통제가 포함되어야 함을 시사합니다.
Drosophila는 짧은 수명주기, 저렴한 비용 및 쉬운 유지 보수로 인해 유전자 기능의 생체 내 조사에 이상적인 모델 유기체입니다. 게놈 전체 유전자 스크리닝은 Drosophila 12,13,14,15의 게놈 전체 형질전환 라이브러리의 구축에 의존합니다. 당사는 이전에 이진 GAL4/업스트림 활성화 서열(GAL4/UAS) 시스템을 기반으로 5551개의 UAS-cDNA/ORF 구조를 생성했으며, 이는 DGRC(Drosophila Genomics Resource Center) Gold Collection16에서 인간에서 보존된 초파리 유전자의 83%를 포괄합니다. UAS-cDNA/ORF 플라스미드는 초파리에서 형질전환 UAS-cDNA/ORF 라이브러리를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 효율적인 배아 미세주입 기술은 형질전환 파리 라이브러리의 생성을 가속화할 수 있습니다.
배아 미세주입의 경우, 바늘 끝은 일반적으로 커버슬립(coverslip)17에 부러진다. 이로 인해 바늘이 막히거나 많은 양의 세포질이 누출되는 경우가 많으며, 이러한 문제가 발생하면 새로운 바늘을 사용해야 합니다. 베벨링 니들은 미세 사출 효율을 향상시킬 수 있지만 연삭 용액은 연삭 공정 중에 베벨 팁으로 들어갑니다. 비스듬한 팁의 분쇄 용액은 자연적으로 빠르게 증발하지 않습니다. 따라서 베벨 링 직후 바늘을 미세 주입에 사용할 수 없습니다. 이러한 요인들은 배아 미세주입 절차의 효율성을 감소시킵니다. 여기에서는 Drosophila 의 phiC31 매개 부위 특이적 transgenesis를 예로 들어 Drosophila의 transgenesis를 위한 배아 미세주입을 위한 프로토콜을 제시합니다. 연삭 용액이 바늘에 들어가는 것을 방지하기 위해 공기 펌프를 사용하여 바늘 내부에 공기 압력을 가하여 연삭 용액이 비스듬한 팁으로 들어가는 것을 방지합니다. 베벨 니들은 베벨링 직후 시료 로딩 및 미세 주입이 가능합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 Drosophila의 transgenesis를 위한 배아 미세주입에 대한 프로토콜을 제시합니다. phiC31 매개 부위 특이적 형질전환(site-specific transgenesis)의 경우, 각 플라스미드에 대해 120-140개의 배아를 주입하고 플라스미드의 약 85%에 대해 하나 이상의 형질전환 라인(transgenic line)을 수득하였다(보충 표 2). 우리의 경험에 따르면, plasmid miniprep kit로 분리한 plasmid DNA는 Drosophila의 transg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국남부대학교(University of South China)의 고위급 인재를 위한 과학 연구 기금(Scientific Research Fund for High-Level Talents)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
- Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3 (Bethesda). 2 (9), 1095-1102 (2012).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
- Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).
- Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3 (Bethesda). 13 (4), jkad022 (2023).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
- Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
- Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).
