الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة
Summary
تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.
Abstract
يعد التحوير الوراثي في ذبابة الفاكهة نهجا أساسيا لدراسة وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي. الحقن المجهري للأجنة هو خطوة حاسمة لبناء الذباب المعدل وراثيا. يتطلب الحقن المجهري بعض أنواع المعدات ، بما في ذلك حاقن دقيق ، ومناور دقيق ، ومجهر مقلوب ، ومجهر ستيريو. البلازميدات المعزولة بمجموعة البلازميد المصغرة مؤهلة للحقن المجهري. تخضع الأجنة في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك ، للحقن المجهري. مصفاة الخلية تخفف من عملية إزالة الأجنة. يجب تحديد الوقت الأمثل لنزع الأجنة وتجفيفها تجريبيا. لزيادة كفاءة الحقن المجهري للأجنة ، يجب أن تكون الإبر التي أعدها مجتذب مشطوفة بواسطة مطحنة إبرة. في عملية طحن الإبر ، نستخدم مضخة هواء القدم مع مقياس ضغط لتجنب التأثير الشعري لطرف الإبرة. نقوم بشكل روتيني بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد ونحصل على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات. تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا مفصلا للحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة.
Introduction
ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster قابلة للغاية للتلاعب الجيني والتحليل الجيني. يستخدم ذباب الفاكهة المعدل وراثيا على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. منذ أن تم تطويره في أوائل ثمانينيات القرن العشرين ، كان التحوير بوساطة P-element transposon لا غنى عنه لأبحاث ذبابة الفاكهة 1. في بعض السيناريوهات ، تم استخدام ترانسبوزونات أخرى ، مثل piggyBac و Minos في الجينات المحورة في ذبابة الفاكهة أيضا2. يتم إدخال جينات التحوير عبر transposon بشكل عشوائي في جينوم ذبابة الفاكهة ، وقد تختلف مستويات التعبير عن الجينات المحورة في مواقع جينومية مختلفة بسبب تأثيرات الموضع وبالتالي لا يمكن مقارنتها2. تم التغلب على هذه العيوب من خلال الجينات المحورة 3 الخاصة بالموقع بوساطة phiC31. يشفر جين phiC31 البكتيري إنزيم التكامل الذي يتوسط إعادة التركيب الخاصة بالتسلسل بين موقعي attB و attP في ذبابة الفاكهة3. تم تمييز العديد من مواقع إرساء attP وهي متوفرة في مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة 3،4،5،6،7،8،9.
تم استخدام نظام التحوير phiC31 لذبابة الفاكهة على نطاق واسع من قبل مجتمع الذباب. من بين مواقع الالتحام attP ، عادة ما تكون attP18 على الكروموسوم X ، و attP40 على الكروموسوم الثاني ، و attP2 على الكروموسوم الثالث هي المواقع المفضلة لتكامل الجينات المحورة على كل كروموسوم لأن جينات التحوير في المواقع الثلاثة تظهر مستويات عالية من التعبير المستحث مع وجود مستويات منخفضة من التعبير القاعدي5. ومع ذلك ، وجد فان دير غراف وزملاؤه مؤخرا أن موقع attP40 ، القريب من موضع جين Msp300 ، والجينات المحورة المدمجة في attP40 تسبب تجمعا نوويا لعضلات اليرقات في ذبابة الفاكهة10. في دراسة حديثة أخرى ، وجد دوان وزملاؤه أن كروموسوم attP40 متماثل الزيجوت يعطل التنظيم الكبيبي الطبيعي لفئة الخلايا العصبية لمستقبلات حاسة الشم Or47b في ذبابة الفاكهة11. تشير هذه النتائج إلى أنه يجب تضمين ضوابط صارمة عند تصميم التجارب وتفسير البيانات.
ذبابة الفاكهة هي كائن نموذجي مثالي للاستجواب في الجسم الحي لوظيفة الجينات بسبب دورة حياتها القصيرة وتكلفتها المنخفضة وسهولة صيانتها. يعتمد الفحص الجيني على مستوى الجينوم على بناء مكتبات معدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة12،13،14،15. لقد أنشأنا سابقا 5551 بنية UAS-cDNA / ORF بناء على نظام تسلسل تنشيط GAL4 / المنبع الثنائي (GAL4 / UAS) ، والذي يغطي 83٪ من جينات ذبابة الفاكهة المحفوظة في البشر في المجموعة الذهبية لمركز موارد جينوم ذبابة الفاكهة (DGRC)16. يمكن استخدام بلازميدات UAS-cDNA / ORF لإنشاء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا في ذبابة الفاكهة. يمكن لتقنية الحقن المجهري للأجنة الفعالة تسريع إنشاء مكتبات الذباب المعدلة وراثيا.
بالنسبة للحقن المجهري للجنين ، عادة ما يتم كسر طرف الإبرة ضد غطاء17. وبالتالي ، غالبا ما تصبح الإبر مسدودة أو تسبب تسرب كميات كبيرة من السيتوبلازم ، وعندما تنشأ هذه المشكلات ، يجب استخدام إبر جديدة. على الرغم من أن إبر الميلا يمكن أن تعزز كفاءة الحقن المجهري ، إلا أن محلول الطحن يدخل الطرف المشطوف أثناء عملية الطحن. لا يتبخر محلول الطحن في الطرف المشطوف بسرعة بشكل طبيعي ؛ لذلك ، لا يمكن استخدام الإبر للحقن المجهري مباشرة بعد الميلات. هذه العوامل تقلل من كفاءة إجراءات الحقن المجهري للأجنة. هنا ، باستخدام الجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 في ذبابة الفاكهة كمثال ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لجين التحوير في ذبابة الفاكهة. لمنع محلول الطحن من دخول الإبرة ، نستخدم مضخة هواء لممارسة ضغط الهواء داخل الإبرة ، وبالتالي منع محلول الطحن من دخول الطرف المشطوف. الإبر المشطوفة جاهزة لتحميل العينات والحقن المجهري مباشرة بعد الميلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لالجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. بالنسبة للجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 ، قمنا بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد وحصلنا على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات (الجدول التكميلي 2). في تجربتنا ، يكفي الحمض الن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل من قبل صندوق البحث العلمي للمواهب رفيعة المستوى ، جامعة جنوب الصين.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
- Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
- Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).
- Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), 022 (2023).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
- Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
- Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).
