胚胎显微注射用于果蝇转基因
Summary
本文以果蝇中 phiC31 整合酶介导的转基因为例，提出了一种优化的胚胎显微注射方案，这是创造转基因果蝇的关键步骤。
Abstract
果蝇的转基因是在生物体水平上研究基因功能的重要方法。胚胎显微注射是构建转基因果蝇的关键步骤。显微注射需要某些类型的设备，包括显微注射器、显微操作器、倒置显微镜和立体显微镜。使用质粒小量制备试剂盒分离的质粒可用于显微注射。对胚层前或合胞体胚层阶段的胚胎进行显微注射，其中细胞核共享一个共同的细胞质。细胞过滤器简化了胚胎去绒毛的过程。胚胎去绒毛膜和干燥的最佳时间需要通过实验确定。为了提高胚胎显微注射的效率，由拉拔器制备的针头需要由针磨机进行斜面处理。在磨针的过程中，我们采用带有压力表的脚踏气泵，以避免针尖的毛细效应。我们为每个质粒常规注射 120-140 个胚胎，并为大约 85% 的质粒获得至少一个转基因系。本文以果蝇中 phiC31 整合酶介导的转基因为例，提出了果蝇胚胎显微注射转基因的详细方案。
Introduction
果蝇 Drosophila melanogaster 极易接受基因操作和遗传分析。转基因果蝇广泛用于生物学研究。自 1980 年代初开发以来，P 元件转座子介导的转基因一直是果蝇研究中不可或缺的1。在某些情况下，其他转座子（如 piggyBac 和 Minos）也已用于果蝇的转基因2。通过转座子的转基因被随机插入果蝇基因组中，不同基因组位点的转基因表达水平可能因位置效应而发生变化，因此无法进行比较2。phiC31 介导的位点特异性转基因3 克服了这些缺点。噬菌体 phiC31 基因编码一种整合酶，该整合酶介导果蝇3 中 attB 和 attP 位点之间的序列特异性重组。许多 attP 停靠位点已被表征，可在布卢明顿果蝇库存中心 3,4,5,6,7,8,9 中使用。
果蝇的 phiC31 转基因系统已被果蝇群落广泛使用。在 attP 停靠位点中，X 染色体上的 attP18、第二条染色体上的 attP40 和第三条染色体上的 attP2 通常是每条染色体上转基因整合的首选位点，因为这三个位点的转基因显示出高水平的诱导表达，而基础表达水平较低5。然而，最近，van der Graaf 及其同事发现，靠近 Msp300 基因位点的 attP40 位点和整合到 attP40 的转基因会导致果蝇10 中的幼虫肌肉核聚集。在最近的另一项研究中，Duan 及其同事发现，纯合子 attP40 染色体破坏了果蝇11 中 Or47b 嗅觉受体神经元类的正常肾小球组织。这些发现表明，在设计实验和解释数据时应包括严格的控制。
果蝇由于其生命周期短、成本低、易于维护，是体内询问基因功能的理想模式生物。全基因组遗传筛选依赖于果蝇 12,13,14,15 中全基因组转基因文库的构建。我们之前基于二元 GAL4/上游激活序列 （GAL4/UAS） 系统生成了 5551 个 UAS-cDNA/ORF 构建体，涵盖了果蝇基因组学资源中心 （DGRC） 黄金收藏16 中人类保守的果蝇基因的 83%。UAS-cDNA/ORF 质粒可用于在果蝇中创建转基因 UAS-cDNA/ORF 文库。高效的胚胎显微注射技术可以加速转基因果蝇文库的创建。
对于胚胎显微注射，针尖通常靠在盖玻片17 上折断。因此，针头经常堵塞或导致大量细胞质泄漏，当这些问题出现时，必须使用新的针头。尽管斜面针可以提高显微注射效率，但研磨液在研磨过程中会进入斜面尖端。斜面尖端中的研磨溶液不会迅速自然蒸发;因此，针头不能在坡口后直接用于显微注射。 这些因素降低了胚胎显微注射程序的效率。在这里，以果 蝇 中 phiC31 介导的位点特异性转基因为例，我们提出了一种用于果 蝇转基因的胚胎显微注射方案。为了防止研磨液进入针头，我们利用气泵在针内施加气压，从而防止研磨液进入斜面尖端。斜面针头在斜面后即可直接用于样品加载和显微注射。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们提出了一种用于果 蝇转基因的胚胎显微注射方案。对于 phiC31 介导的位点特异性转基因，我们为每个质粒注射 120-140 个胚胎，并为大约 85% 的质粒获得至少一个转基因系（补充表 2）。根据我们的经验，通过质粒小量制备试剂盒分离的质粒 DNA 足以在 果蝇中转基因。质粒 DNA 浓度范围为 20 ng/μL 至 1683 ng/μL，可能对转基因成功率没有明显影响，因为它们中的大…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了南华大学高层次人才科研基金的支持。
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
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