Микроинъекция эмбриона для трансгенеза у дрозофилы
Summary
В этой статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен оптимизированный протокол микроинъекции эмбриона, что является важным шагом для создания трансгенных мух.
Abstract
Трансгенез у дрозофил является важным подходом к изучению функции генов на уровне организма. Микроинъекция эмбриона является важным этапом для создания трансгенных мух. Для микроинъекции требуются некоторые виды оборудования, в том числе микроинъектор, микроманипулятор, инвертированный микроскоп и стереомикроскоп. Плазмиды, выделенные с помощью набора для мини-подготовки плазмид, подходят для микроинъекций. Эмбрионы на стадии пребластодермы или синцитиальной бластодермы, где ядра имеют общую цитоплазму, подвергаются микроинъекции. Клеточный фильтр облегчает процесс дехорионизации эмбрионов. Оптимальное время для дехорионации и высыхания эмбрионов необходимо определить экспериментальным путем. Чтобы повысить эффективность микроинъекции эмбриона, иглы, подготовленные пуллером, должны быть скошены игольчатой машиной. В процессе шлифовки игл мы используем ножной воздушный насос с манометром, чтобы избежать капиллярного эффекта кончика иглы. Мы обычно вводим 120-140 эмбрионов для каждой плазмиды и получаем по крайней мере одну трансгенную линию примерно для 85% плазмид. В данной статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен подробный протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы.
Introduction
Плодовая муха Drosophila melanogaster чрезвычайно поддается генетическим манипуляциям и генетическому анализу. Трансгенные плодовые мушки широко используются в биологических исследованиях. С момента своего появления в начале 1980-х годов транспозон-опосредованный P-элементами транспозон-опосредованный был незаменимдля исследований дрозофил. В некоторых сценариях другие транспозоны, такие как piggyBac и Minos, также использовались для трансгенеза у дрозофил 2. Трансгены через транспозон случайным образом встраиваются в геном дрозофилы, и уровни экспрессии трансгенов в разных геномных локусах могут варьироваться из-за позиционных эффектов и поэтому немогут быть сравнены. Эти недостатки были преодолены с помощью phiC31-опосредованного сайт-специфического трансгенеза3. Ген бактериофага phiC31 кодирует интегразу, которая опосредует последовательно-специфическую рекомбинацию между сайтами attB и attP у дрозофилы 3. Многие стыковочные площадки attP были охарактеризованы и доступны в Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.
Система трансгенеза phiC31 для дрозофилы широко используется сообществом мух. Среди сайтов стыковки attP attP18 на Х-хромосоме, attP40 на второй хромосоме и attP2 на третьей хромосоме обычно являются предпочтительными сайтами для интеграции трансгенов на каждой хромосоме, поскольку трансгены в трех сайтах демонстрируют высокие уровни индуцируемой экспрессии при низких уровнях базальнойэкспрессии5. Однако недавно ван дер Грааф и его коллеги обнаружили, что сайт attP40, близкий к локусу гена Msp300, и трансгены, интегрированные в attP40, вызывают кластеризацию ядра личиночных мышц у дрозофилы10. В другом недавнем исследовании Дуан и его коллеги обнаружили, что гомозиготная хромосома attP40 нарушает нормальную клубочковую организацию класса нейронов обонятельных рецепторов Or47b у дрозофилы11. Эти результаты свидетельствуют о том, что при планировании экспериментов и интерпретации данных следует учитывать строгий контроль.
Дрозофила является идеальным модельным организмом для исследования функции генов in vivo благодаря своему короткому жизненному циклу, низкой стоимости и простоте обслуживания. Полногеномный генетический скрининг основан на построении полногеномных трансгенных библиотек у дрозофил 12,13,14,15. Ранее мы создали 5551 конструкцию UAS-кДНК/ORF на основе бинарной системы GAL4/восходящей активирующей последовательности (GAL4/UAS), охватывающей 83% генов дрозофилы, сохраненных у человека в Золотой коллекции Центра геномики дрозофилы (DGRC)Gold Collection 16. Плазмиды UAS-кДНК/ORF могут быть использованы для создания трансгенной библиотеки UAS-кДНК/ORF у дрозофил. Эффективная технология микроинъекций эмбрионов может ускорить создание трансгенных библиотек мух.
При микроинъекции эмбриона кончик иглы обычно ломается о покровное стекло17. Таким образом, иглы часто засоряются или вызывают утечку большого количества цитоплазмы, и когда возникают эти проблемы, необходимо использовать новые иглы. Несмотря на то, что иглы для снятия фаски могут повысить эффективность микровпрыска, измельчающий раствор попадает на скошенный наконечник в процессе шлифования. Шлифовальный раствор в скошенном наконечнике не испаряется быстро естественным путем; Поэтому иглы нельзя использовать для микроинъекций сразу после снятия фаски. Эти факторы снижают эффективность процедур микроинъекций эмбрионов. Здесь, используя в качестве примера phiC31-опосредованный сайт-специфический трансгенез у дрозофилы , мы представляем протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы. Чтобы предотвратить попадание шлифовального раствора в иглу, мы используем воздушный насос для создания давления воздуха внутри иглы, тем самым предотвращая попадание шлифовального раствора на скошенный кончик. Скошенные иглы готовы к загрузке образца и микровпрыску сразу после снятия фаски.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы. Для phiC31-опосредованного сайт-специфического трансгенеза мы вводили 120-140 эмбрионов в каждую плазмиду и получали, по крайней мере, одну трансгенную линию примерно для 85% плазмид (дополнительная ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Фонда научных исследований талантов высокого уровня Университета Южного Китая.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
- Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
- Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).
- Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), 022 (2023).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
- Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
- Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).
