מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה
Summary
מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.
Abstract
טרנסגנזה בדרוזופילה היא גישה חיונית לחקר תפקוד גנים ברמת האורגניזם. מיקרו-הזרקה של עוברים היא צעד מכריע לבניית זבובים טרנסגניים. מיקרו-הזרקה דורשת סוגים מסוימים של ציוד, כולל מיקרו-מזרק, מיקרומניפולטור, מיקרוסקופ הפוך ומיקרוסקופ סטריאו. פלסמידים מבודדים עם ערכת מיני הכנה פלסמיד מוסמכים למיקרו-הזרקה. עוברים בשלב הפרה-בלסטודרם או הבלסטודרם הסינסיטיאלי, שבו גרעינים חולקים ציטופלסמה משותפת, נתונים למיקרו-הזרקה. מסננת תאים מקלה על תהליך הדה-כוריוניזציה של עוברים. הזמן האופטימלי לדכוריונציה וייבוש של עוברים צריך להיקבע באופן ניסיוני. כדי להגביר את היעילות של מיקרו-הזרקה עוברית, מחטים שהוכנו על ידי מושך צריכות להיות משופעות על ידי מטחנת מחט. בתהליך השחזת מחטים, אנו משתמשים במשאבת אוויר לרגל עם מד לחץ כדי למנוע את ההשפעה הנימית של קצה המחט. אנו מזריקים באופן שגרתי 120-140 עוברים לכל פלסמיד ומשיגים לפחות קו מהונדס אחד עבור כ-85% מהפלסמידים. מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך integrase phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול מפורט למיקרו-הזרקה של עוברים לטרנסגנזה בדרוזופילה.
Introduction
זבוב הפירות Drosophila melanogaster מקובל מאוד על מניפולציה גנטית וניתוח גנטי. זבובי פירות טרנסגניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביולוגי. מאז שפותחה בתחילת שנות השמונים, טרנסגנזה בתיווך טרנספוזון של אלמנט P הייתה הכרחית למחקר דרוזופילה 1. בתרחישים מסוימים, טרנספוזונים אחרים, כגון piggyBac ומינוס שימשו לטרנסגנזה גם בדרוזופילה 2. טרנסגנים באמצעות טרנספוזון מוחדרים באופן אקראי לגנום דרוזופילה, ורמות הביטוי של טרנסגנים באתרים גנומיים שונים עשויות להשתנות בהתאם להשפעות המיקום ולכן לאניתן להשוות 2. חסרונות אלה התגברו על ידי טרנסגנזה ספציפית לאתרבתיווך phiC31 3. הגן phiC31 של הבקטריופאג’ מקודד אינטגראז המתווך רקומבינציה ספציפית לרצף בין אתרי attB ו-attP בדרוזופילה3. אתרי עגינה רבים של attP אופיינו וזמינים במרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה 3,4,5,6,7,8,9.
מערכת הטרנסגנזה phiC31 עבור דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב על ידי קהילת הזבובים. מבין אתרי העגינה של attP, attP18 בכרומוזום X, attP40 בכרומוזום השני ו-attP2 בכרומוזום השלישי הם בדרך כלל האתרים המועדפים לשילוב טרנסגנים בכל כרומוזום מכיוון שטרנסגנים בשלושת האתרים מראים רמות גבוהות של ביטוי אינדוקטיבי בעוד רמות נמוכות של ביטוי בסיסי5. עם זאת, לאחרונה, ואן דר גראף ועמיתיו מצאו כי אתר attP40, קרוב למוקד הגן Msp300, וטרנסגנים המשולבים ב- attP40 גורמים להתקבצות גרעינית של שרירי הזחל בדרוזופילה10. במחקר אחר שנערך לאחרונה, דואן ועמיתיו מצאו כי כרומוזום attP40 הומוזיגוטי משבש את הארגון הגלומרולרי הנורמלי של קבוצת נוירוני קולטן הריח Or47b בדרוזופילה11. ממצאים אלה מצביעים על כך שיש לכלול בקרות קפדניות בעת תכנון ניסויים ופירוש נתונים.
דרוזופילה היא אורגניזם מודל אידיאלי לחקירה in vivo של תפקוד גנים בשל מחזור החיים הקצר שלה, עלות נמוכה ותחזוקה קלה. סריקה גנטית כלל-גנומית מסתמכת על בניית ספריות טרנסגניות כלל-גנומיות בדרוזופילה 12,13,14,15. יצרנו בעבר 5551 מבני UAS-cDNA/ORF המבוססים על מערכת רצף ההפעלה הבינארי GAL4/upstream (GAL4/UAS), המכסים 83% מהגנים של דרוזופילה השמורים בבני אדם באוסף הזהב של מרכז המשאבים לגנומיקה דרוזופילה (DGRC)16. פלסמידים UAS-cDNA/ORF יכולים לשמש ליצירת ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית בדרוזופילה. טכנולוגיית מיקרו-הזרקה יעילה של עוברים יכולה להאיץ את יצירתן של ספריות זבובים טרנסגניות.
עבור מיקרו-הזרקה עוברית, קצה המחט נשבר בדרך כלל כנגד כיסוי17. לכן, מחטים לעיתים קרובות נסתמות או גורמות לדליפה של כמויות גדולות של ציטופלסמה, וכאשר בעיות אלה מתעוררות, יש להשתמש במחטים חדשות. למרות שמחטים משופעות יכולות לשפר את יעילות המיקרו-הזרקה, תמיסת השחזה נכנסת לקצה המשופע במהלך תהליך השחזה. תמיסת השחזה בקצה המשופע אינה מתאדה במהירות באופן טבעי; לכן, מחטים לא ניתן להשתמש עבור microinjection מיד לאחר שיקוע. גורמים אלה מפחיתים את היעילות של הליכי מיקרו-הזרקה עובריים. כאן, תוך שימוש בטרנסגנזה ספציפית לאתר בתיווך phiC31 בדרוזופילה כדוגמה, אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה. כדי למנוע מתמיסת השחזה להיכנס למחט, אנו משתמשים במשאבת אוויר כדי להפעיל לחץ אוויר בתוך המחט, ובכך למנוע מתמיסת השחזה להיכנס לקצה המשופע. מחטים משופעות מוכנות להעמסת דגימות ולמיקרו-הזרקה מיד לאחר השיקוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-הזרקה של עוברים לטרנסגנזה בדרוזופילה. עבור טרנסגנזה ספציפית לאתר בתיווך phiC31, הזרקנו 120-140 עוברים לכל פלסמיד וקיבלנו לפחות קו מהונדס אחד עבור כ-85% מהפלסמידים (טבלה משלימה 2). מניסיוננו, DNA פלסמיד שבודד על ידי ערכת הכנה פלסמיד מספיק לטרנסגנזה בדר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי קרן המחקר המדעי לכישרונות ברמה גבוהה, אוניברסיטת דרום סין.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
- Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3 (Bethesda). 2 (9), 1095-1102 (2012).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
- Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).
- Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3 (Bethesda). 13 (4), jkad022 (2023).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
- Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
- Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).
