Temel Kayıt: Drosophila'da Tat Nöronlarının Tepkilerini Analiz Etmek İçin Bir Teknik
Summary
Nadiren kullanılan bir elektrofizyolojik kayıt yöntemi olan temel kayıt, geleneksel kayıt yöntemleriyle incelenemeyen tat kodlama özelliklerinin analizine olanak tanır. Temel kayıt, geleneksel elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak incelenemeyen hidrofobik uyaranlara verilen tat tepkilerinin analizine de izin verir.
Abstract
Böcekler, uçlarında gözenekler bulunan tat tüyleri veya sensilla yoluyla dış dünyanın tadına bakarlar. Bir sensillum potansiyel bir besin kaynağı ile temas ettiğinde, besin kaynağından gelen bileşikler gözenekten girer ve içindeki nöronları aktive eder. 50 yılı aşkın bir süredir, bu yanıtlar ipucu kaydı adı verilen bir teknik kullanılarak kaydedilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin, uyaran temasından önce veya sonra nöral aktivitenin ölçülememesi ve tatların sulu çözeltilerde çözünür olması gerekliliği dahil olmak üzere önemli sınırlamaları vardır. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelen temel kayıt dediğimiz bir tekniği açıklıyoruz. Temel kayıt, uyaran öncesinde, sırasında ve sonrasında tat nöron aktivitesinin ölçülmesine izin verir. Böylece, bir tat uyaranından sonra ortaya çıkan OFF tepkilerinin kapsamlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar. Suda çözünürlüğü çok düşük olan uzun zincirli feromonlar gibi hidrofobik bileşikleri incelemek için kullanılabilir. Özetle, temel kayıt, nöronal aktiviteyi ölçmenin bir yolu olarak tek sensillum elektrofizyolojisinin avantajlarını sunar – genetik araçlara ihtiyaç duymadan yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük – ve geleneksel uç kayıt tekniğinin temel sınırlamalarının üstesinden gelir.
Introduction
Drosophilid sinekleri de dahil olmak üzere böcekler, çevrelerinden karmaşık kimyasal bilgiler çıkarmalarını sağlayan sofistike bir tat sistemine sahiptir. Bu sistem, besleyici ve zararlı olanları ayırt ederek çeşitli maddelerin kimyasal bileşimini ayırt etmelerini sağlar 1,2.
Bu sistemin merkezinde, stratejik olarak çeşitli vücut kısımlarına yerleştirilmiş, tat kılları veya sensilla olarak bilinen özel yapılar bulunur. Drosophilid sineklerinde, bu sensillalar, sinek başının 1,2,3,4 ana tat organı olan labellum üzerinde, ayrıca bacaklarda ve kanatlarda 1,2,5,6 bulunur. Labellum, hortumun ucunda bulunur ve iki lob 4,7,8 içerir. Her lob kısa, uzun ve orta 4,7,8 olarak kategorize edilen 31 tat duyusu ile kaplıdır. Bu duyuların her biri 2-4 tat nöronları 1,2,9,10. Bu tat nöronları, Tat reseptörü (Gr), İyonotropik reseptör (Ir), Yankesici (Ppk) ve Geçici reseptör potansiyeli (Trp) genleri 1,2,11,12,13 olmak üzere en az dört farklı gen ailesinin üyelerini eksprese eder . Bu reseptör ve kanal çeşitliliği, böcekleri hem uçucu olmayan hem de uçucu ipuçları 1,2,14 dahil olmak üzere çok çeşitli kimyasal bileşikleri tanıma yeteneği ile donatır.
50 yılı aşkın bir süredir, bilim adamları tat nöronlarının ve reseptörlerinin tepkisini, 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Ancak, bu yöntemin büyük sınırlamaları vardır. İlk olarak, nöral aktivite sadece uyaranla temas sırasında ölçülebilir, temastan önce veya sonra değil. Bu sınırlama, spontan spiking aktivitesinin ölçümünü engeller ve OFF yanıtlarının ölçümünü engeller. İkincisi, sadece sulu çözeltilerde çözünen tatlar test edilebilir.
Bu sınırlamalar, “temel kayıt” adı verilen nadiren kullanılan alternatif bir elektrofizyolojik teknikle aşılabilir. Burada, Marion-Poll ve meslektaşları24 tarafından kullanılan bir yöntemden uyarladığımız bu tekniği açıklıyoruz ve artık rahatça ölçebildiği önemli tat kodlama özelliklerinigösteriyoruz 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bazı sensilla türlerinden elde edilen kayıtlarda, farklı nöronların sivri uçlarını ayırt etmek zor olabilir. Örneğin, S ve I sensilla’nın şeker nöronları ve mekanosensoriyel nöronları, benzer genliklerde sivri uçlar üretirve bu da onları ayırt etmeyi zorlaştırır 4,14. Çok keskin bir tungsten kayıt elektrodunun kullanılmasının, kayıt elektrodunun akıllıca yerleştirilmesi gibi, mekanosensoriyel nöronun ateşlenmesini azalttığın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Destek için Zina Berman’a, el yazması hakkındaki yorumları için Lisa Baik’e ve tartışma için Carlson laboratuvarının diğer üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, H.K.M.D.’ye DC020145 NIH hibesi K01 tarafından desteklenmiştir; ve NIH, JRC’ye R01 DC02174, R01 DC04729 ve R01 DC011697 verir.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
- Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
- Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
- Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
- Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
- Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
- Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
- Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
- Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
- Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
- Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
- Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
- Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
- Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
- Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
