Summary

Registro de bases: una técnica para analizar las respuestas de las neuronas gustativas en Drosophila

Published: March 01, 2024
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Summary

Un método de registro electrofisiológico poco utilizado, el registro de base, permite el análisis de las características de la codificación del gusto que no pueden ser examinadas por los métodos convencionales de registro. El registro de la base también permite el análisis de las respuestas gustativas a estímulos hidrofóbicos que no pueden estudiarse con los métodos electrofisiológicos tradicionales.

Abstract

Los insectos saborean el mundo exterior a través de pelos gustativos, o sensilla, que tienen poros en sus puntas. Cuando un sensillum entra en contacto con una fuente potencial de alimento, los compuestos de la fuente de alimento entran a través del poro y activan las neuronas internas. Durante más de 50 años, estas respuestas se han registrado utilizando una técnica llamada registro de propinas. Sin embargo, este método tiene limitaciones importantes, incluida la incapacidad de medir la actividad neuronal antes o después del contacto con el estímulo y el requisito de que los saborantes sean solubles en soluciones acuosas. Describimos aquí una técnica que denominamos grabación base, que supera estas limitaciones. El registro de bases permite medir la actividad de las neuronas gustativas antes, durante y después del estímulo. Por lo tanto, permite un análisis exhaustivo de las respuestas OFF que ocurren después de un estímulo gustativo. Se puede utilizar para estudiar compuestos hidrofóbicos como las feromonas de cadena larga que tienen una solubilidad muy baja en agua. En resumen, el registro de bases ofrece las ventajas de la electrofisiología de un solo sensillum como medio para medir la actividad neuronal (alta resolución espacial y temporal, sin necesidad de herramientas genéticas) y supera las limitaciones clave de la técnica tradicional de registro de puntas.

Introduction

Los insectos, incluidas las moscas drosófilas, están dotados de un sofisticado sistema de sabor que les permite extraer información química compleja de su entorno. Este sistema les permite discernir la composición química de diversas sustancias, distinguiendo entre las que son nutritivas y las que son dañinas 1,2.

En el núcleo de este sistema se encuentran estructuras especializadas conocidas como pelos gustativos o sensilla, ubicadas estratégicamente en varias partes del cuerpo. En las moscas drosófilas, estas sensilas se encuentran en el labelo, que es el principal órgano gustativo de la cabeza de la mosca 1,2,3,4, así como en las patas y alas 1,2,5,6. El labelo se encuentra en la punta de la probóscide y contiene dos lóbulos 4,7,8. Cada lóbulo está cubierto con 31 sensillas gustativas categorizadas como cortas, largas e intermedias 4,7,8. Cada uno de estos sensilla alberga de 2 a 4 neuronas gustativas 1,2,9,10. Estas neuronas gustativas expresan miembros de al menos cuatro familias de genes diferentes, a saber, los genes receptor gustativo (Gr), receptor ionotrópico (Ir), carterista (Ppk) y receptor de potencial transitorio (Trp) 1,2,11,12,13. Esta diversidad de receptores y canales dota a los insectos de la capacidad de reconocer una amplia gama de compuestos químicos, incluyendo tanto las señales no volátiles como las volátiles 1,2,14.

Durante más de 50 años, los científicos han cuantificado la respuesta de las neuronas gustativas y sus receptores utilizando una técnica llamada registro de puntas 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Sin embargo, este método tiene importantes limitaciones. En primer lugar, la actividad neuronal sólo puede medirse durante el contacto con el estímulo, y no antes o después del contacto. Esta limitación impide la medición de la actividad de aumento espontáneo e impide la medición de las respuestas OFF. En segundo lugar, solo se pueden probar los saborizantes que son solubles en soluciones acuosas.

Estas limitaciones pueden superarse mediante una técnica electrofisiológica alternativa poco utilizada llamada “registro base”. Aquí describimos esta técnica, que hemos adaptado de un método utilizado por Marion-Poll y sus colegas24, y mostramos las características cruciales de codificación del sabor que ahora puede medir convenientemente14.

Protocol

El siguiente protocolo cumple con todas las pautas de cuidado animal de la Universidad de Yale. 1. Moscas Colocar de 10 a 15 moscas recién emergidas en viales de cultivo estándar frescos a 25 °C y 60% de humedad relativa en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h. Use moscas cuando tenga de 3 a 7 días de edad. 2. Estímulos quimiosensoriales Obtener estímulos quimiosensoriales de la más alta pureza disponible. Guárdelos según lo recomendado por el proveedor hasta su uso. Disuelva los estímulos quimiosensoriales y diluya hasta las concentraciones deseadas en agua u otro solvente no tóxico deseado, como el aceite de parafina. Agitar las soluciones preparadas durante un mínimo de 1 h en el caso de compuestos sólidos disueltos. 3. Estímulo de vidrio capilar Tire de un capilar de vidrio para contener el estímulo de un capilar de vidrio de borosilicato (100 mm de longitud, 1 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interior) utilizando un instrumento extractor de pipetas. Trate de lograr un diámetro de punta entre 3 μm y 10 μm. Llene el capilar de vidrio con la solución de estímulo preferida utilizando la punta de una pipeta con microcargador. Tenga cuidado de evitar las burbujas, que se pueden eliminar con un suave golpecito. Si el estímulo se cristaliza en la punta, limpie o reemplace el capilar de estímulo de vidrio. 4. Electrodos de referencia y registro Utilice varillas de tungsteno (127 μm de diámetro y 76,2 mm de longitud) para los electrodos de referencia y de registro. Afile los electrodos de referencia y de registro hasta aproximadamente 1 μm de diámetro en la punta (las formas de estos electrodos se describen en Delventhal et al.36) sumergiéndolos repetidamente durante varios segundos en una solución de KNO3 al 10% (~1 M) o en una solución de KOH al 10% (1,8 M).NOTA: Esta solución requiere corriente (0,3-3 mA) para facilitar este proceso. 5. Preparación de la mosca para el registro de la base Extraiga una sola mosca del vial y conéctela a un aspirador. Retire el aspirador y atrape al animal colocando un dedo sobre el extremo. Expulse la mosca en una punta de pipeta de plástico de 200 μL. Manteniendo el extremo del aspirador en la punta de la pipeta, utilice el extremo para empujar la mosca hacia adelante, de cabeza, hacia el extremo estrecho de la punta de la pipeta. Recorte la punta de la pipeta en cada extremo (es decir, anterior y posterior al animal) con una cuchilla de afeitar. Use arcilla o un pequeño trozo de algodón para empujar la mosca hacia adelante, hasta que la mitad de la cabeza sobresalga del extremo de la punta de la pipeta recortada. Use fórceps para empujar suavemente hasta que el labelo en la parte delantera de la cabeza quede expuesto. Fije la punta de pipeta recortada en un portaobjetos de vidrio para microscopio con arcilla (Figura 1). Bajo el microscopio estereoscópico, coloque el labelo lateralmente en un cubreobjetos de modo que un lóbulo, junto con sus 31 sensilas gustativas, quede expuesto (Figura 1). El cubreobjetos mantiene el labelo en su lugar. 6. Equipo de electrofisiología Seleccione una habitación para la instalación del equipo que tenga una temperatura y humedad relativa estables (<70%) y que esté aislada de fuentes de ruido eléctrico y mecánico, como refrigeradores y centrífugas. Coloque el microscopio en el centro de una mesa antivibratoria. Fije un micromanipulador manual a la mesa antivibratoria (Figura 2). Conecte un eje de acero inoxidable que sostiene el electrodo de referencia de tungsteno al micromanipulador manual (Figura 2). Conecte los manipuladores motorizados, uno con un soporte para la sonda del electrodo registrador y un segundo con un soporte conectado a un eje de acero inoxidable para el capilar de estímulo de vidrio, a la misma mesa mediante soportes (Figura 2). Conecte la sonda del electrodo registrador a un sistema de controlador inteligente de adquisición de datos (IDAC) u otro sistema amplificador/digitalizador. Conecte este sistema IDAC al ordenador de la estación de trabajo. Conecte los manipuladores manuales y motorizados a la misma ubicación dentro de la plataforma. Instale el software de adquisición adecuado para el sistema IDAC en el equipo. Asegúrese de que los controladores de adquisición digital sean compatibles con el sistema operativo (por ejemplo, Windows XP-7, -8 o -10) del equipo. 7. Grabación de la sensilla del gusto Coloque el portaobjetos de preparación en la platina del microscopio con un objetivo de bajo aumento (por ejemplo, 10x) en posición. Mueva la platina hasta que el labelo esté enfocado en el centro del campo de visión tanto en objetivos de baja ampliación como de gran aumento (por ejemplo, 50x). Inserte el electrodo de referencia en el ojo utilizando el objetivo de aumento bajo. Para insertar el electrodo de referencia, apunte el ojo en el lado de la mosca opuesto al lado con el electrodo de registro, por ejemplo, si el electrodo de registro se acerca desde la derecha, coloque el electrodo de referencia en el ojo izquierdo. Utilice un micromanipulador manual para una inserción precisa. Coloque la punta del capilar de estímulo de vidrio en el centro del campo de visión de los objetivos de bajo y alto aumento utilizando un micromanipulador motorizado (Figura 3). Con un aumento bajo, acerque el electrodo de registro al labelo utilizando un segundo micromanipulador motorizado. Con un gran aumento, inserte el electrodo de registro en la base de un sensor de sabor utilizando el micromanipulador motorizado hasta que se escuche el sonido de la actividad de disparo neuronal de la salida de audio del sistema IDAC. Una vez que se haya establecido una señal estable, comience a grabar la señal utilizando el software que viene con el sistema IDAC (Figura 4A-D). Para comenzar a grabar, presione el botón Iniciar grabación. Lleve la punta del capilar del vidrio estimulante para cubrir la punta del sensillum del gusto utilizando el manipulador motorizado. Para finalizar el estímulo, retire el capilar de estímulo de vidrio del sensillum utilizando el manipulador motorizado. Marque el inicio y el final de la estimulación manualmente con un pedal. El pedal está conectado al IDAC, y su comunicación con el software se facilita a través del IDAC para marcar el inicio/fin del estímulo. 8. Análisis Utilice las diferentes funciones del software que viene con el sistema IDAC para clasificar las poblaciones de picos por amplitud (cuando sea posible) y analizar la dinámica de respuesta.Para contar los picos, haga clic con el botón izquierdo en el registro de interés, mostrando una ventana para seleccionar. Elija A picos, iniciando otra ventana denominada Convertir ondas en picos. Introduzca un nombre en el campo Nuevo y pulse el botón Aceptar . Al introducir el nombre en el campo Nuevo en el paso 8.1.1, se accede a la vista Histograma de amplitud . Elija la amplitud que desea contar y, a continuación, cierre esta vista. Haga clic con el botón izquierdo para agregar un contador. Examine los picos manualmente para confirmar las conclusiones basadas en el análisis con software.NOTA: El software también permite la exportación de datos en diferentes formatos para su posterior análisis.

Representative Results

La figura 4A muestra picos espontáneos que surgen de un sensillum. Se dividen en dos clases según la amplitud, con los picos más grandes que se derivan de la neurona que es sensible a los compuestos amargos y los picos más pequeños de la neurona que responde a los azúcares. La relación entre la amplitud de la espícula y la especificidad funcional ha sido corroborada por experimentos genéticos 4,14,37,38,39 .<sup …

Discussion

En las grabaciones de algunos tipos de sensilla, puede ser difícil diferenciar los picos de las diferentes neuronas. Por ejemplo, las neuronas de azúcar y las neuronas mecanosensoriales de las sensillas S e I producen picos de amplitudes similares, lo que dificulta su distinción 4,14. Encontramos que el uso de un electrodo registrador de tungsteno muy afilado reduce la activación de la neurona mecanosensorial, al igual que la colocación juiciosa del electrod…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Zina Berman por su apoyo, a Lisa Baik por sus comentarios sobre el manuscrito y a otros miembros del laboratorio Carlson por su discusión. Este trabajo fue apoyado por la subvención K01 de los NIH DC020145 a H.K.M.D; y los NIH otorgan R01 DC02174, R01 DC04729 y R01 DC011697 a J.R.C.

Materials

Microscope Olympus BX51WI equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration Table TMC 63-7590E
motorized Micromanipulators Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual Micromanipulators Märzhäuser Micromanipulators MM33 Micromanipulator
Magnetic stands ENCO Model #625-0930
Reference  and recording Electrode Holder Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary Holder Ockenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended Probe Ockenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus Controllers Ockenfels Syntech GmbH Stimulus Controller CS 55
Personal Computer Dell Vostro Check for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten Rod A-M Systems Cat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday Cage Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Pipette Puller Sutter Instrument Company Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Stereomicroscope Olympus VMZ 1x-4x For fly preparation
p200 Pipette Tips Generic
Microloader tips  Eppendorf E5242956003
1 ml Syringe Generic
Crocodile clips
Power Transformers STACO ENERGY PRODUCTS STACO 3PN221B Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay Generic
Forceps Generic
Plastic Tubing Saint Gobain Tygon S3™ E-3603
Standard culture vials Archon Scientific Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER) Sigma-Aldrich Cat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN) Sigma-Aldrich Cat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) Sigma-Aldrich Cat# 36542

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Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (205), e66665, doi:10.3791/66665 (2024).

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