Базовая запись: метод анализа реакций вкусовых нейронов у дрозофил
Summary
Редко используемый метод электрофизиологической записи, базовая запись, позволяет анализировать особенности кодирования вкуса, которые не могут быть исследованы обычными методами записи. Регистрация оснований также позволяет анализировать вкусовые реакции на гидрофобные стимулы, которые не могут быть изучены с помощью традиционных электрофизиологических методов.
Abstract
Насекомые пробуют внешний мир через вкусовые волоски, или сенсиллы, которые имеют поры на кончиках. Когда сенсиллум вступает в контакт с потенциальным источником пищи, соединения из источника пищи проникают через поры и активируют нейроны внутри. На протяжении более 50 лет эти ответы записывались с помощью техники, называемой записью наконечников. Однако этот метод имеет серьезные ограничения, в том числе невозможность измерения нейронной активности до или после контакта со стимулом и требование, чтобы вкусовые вещества растворялись в водных растворах. Здесь мы описываем технику, которую мы называем базовой записью, которая преодолевает эти ограничения. Базовая запись позволяет измерять активность вкусовых нейронов до, во время и после стимула. Таким образом, он позволяет проводить обширный анализ реакций OFF, которые возникают после вкусового стимула. Его можно использовать для изучения гидрофобных соединений, таких как длинноцепочечные феромоны, которые имеют очень низкую растворимость в воде. Таким образом, регистрация оснований предлагает преимущества электрофизиологии с одним сенсиллумом в качестве средства измерения активности нейронов – высокое пространственное и временное разрешение, без необходимости использования генетических инструментов – и преодолевает ключевые ограничения традиционной техники записи зондов.
Introduction
Насекомые, в том числе дрозофилы, наделены сложной системой вкуса, которая позволяет им извлекать сложную химическую информацию из окружающей среды. Эта система позволяет им различать химический состав различных веществ, различая питательные и вредные 1,2.
В основе этой системы лежат специализированные структуры, известные как вкусовые волоски или сенсиллы, стратегически расположенные на различных частях тела. У мух-дрозофил эти сенсиллы расположены на лабеллуме, который является основным органом вкуса головы мухи 1,2,3,4, а также на ногах и крыльях 1,2,5,6. Лабеллум расположен на кончике хоботка и содержит две лопасти 4,7,8. Каждая доля покрыта 31 вкусовой сенсиллой, классифицируемой как короткая, длинная и промежуточная 4,7,8. Каждая из этих сенсилл содержит 2-4 вкусовых нейрона: 1,2,9,10. Эти вкусовые нейроны экспрессируют членов по крайней мере четырех различных семейств генов, а именно: вкусовых рецепторов (Gr), ионотропных рецепторов (Ir), карманных (Ppk) и транзиторных рецепторных потенциалов (Trp) 1,2,11,12,13 . Это разнообразие рецепторов и каналов наделяет насекомых способностью распознавать широкий спектр химических соединений, включая как нелетучие, так и летучие сигналы 1,2,14.
На протяжении более 50 лет ученые количественно оценивали реакцию вкусовых нейронов и их рецепторов, используя технику, называемую записью наконечников 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Однако этот метод имеет серьезные ограничения. Во-первых, нейронную активность можно измерить только во время контакта со стимулом, а не до или после контакта. Это ограничение исключает измерение спонтанной спайковой активности и предотвращает измерение реакций OFF. Во-вторых, тестировать можно только вкусовые вещества, растворимые в водных растворах.
Эти ограничения могут быть преодолены с помощью редко используемого альтернативного электрофизиологического метода, называемого «записью оснований». Здесь мы опишем эту технику, которую мы адаптировали из метода, используемого Марион-Полл и коллегами24, и покажем важнейшие особенности кодирования вкуса, которые теперь можно удобно измерить14.
Protocol
Representative Results
Discussion
В записях от некоторых типов сенсилл может быть сложно дифференцировать шипы разных нейронов. Например, сахарные нейроны и механосенсорные нейроны S и I сенсиллы производят спайки одинаковых амплитуд, что затрудняет их различие 4,14. Мы обнаружили, что исп?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Зину Берман за поддержку, Лизу Байк за комментарии к рукописи и других членов лаборатории Карлсона за обсуждение. Эта работа была поддержана грантом NIH K01 DC020145 H.K.M.D.; и NIH предоставляет R01 DC02174, R01 DC04729 и R01 DC011697 J.R.C.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
- Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
- Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
- Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
- Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
- Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
- Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
- Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
- Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
- Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
- Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
- Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
- Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
- Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
- Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
