הקלטת בסיס: טכניקה לניתוח תגובות של נוירוני טעם בדרוזופילה
Summary
שיטה נדירה של הקלטה אלקטרופיזיולוגית, הקלטת בסיס, מאפשרת ניתוח של תכונות של קידוד טעם שלא ניתן לבחון בשיטות הקלטה קונבנציונליות. הקלטה בסיסית מאפשרת גם ניתוח תגובות טעם לגירויים הידרופוביים שלא ניתן לחקור בשיטות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות.
Abstract
חרקים טועמים את העולם החיצוני דרך שערות טעם, או סנסילה, שיש להן נקבוביות בקצותיהם. כאשר סנסילום בא במגע עם מקור מזון פוטנציאלי, תרכובות ממקור המזון נכנסות דרך הנקבוביות ומפעילות תאי עצב בפנים. במשך יותר מ-50 שנה, תגובות אלה תועדו באמצעות טכניקה הנקראת הקלטת טיפים. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות משמעותיות, כולל חוסר היכולת למדוד פעילות עצבית לפני או אחרי מגע גירוי והדרישה לטעימות להיות מסיסות בתמיסות מימיות. אנו מתארים כאן טכניקה שאנו מכנים הקלטה בסיסית, המתגברת על מגבלות אלה. רישום בסיס מאפשר מדידה של פעילות נוירוני הטעם לפני, במהלך ואחרי הגירוי. לפיכך, הוא מאפשר ניתוח נרחב של תגובות OFF המתרחשות לאחר גירוי טעם. ניתן להשתמש בו כדי לחקור תרכובות הידרופוביות כגון פרומונים ארוכי שרשרת בעלי מסיסות נמוכה מאוד במים. לסיכום, הקלטה בסיסית מציעה את היתרונות של אלקטרופיזיולוגיה חד-חושית כאמצעי למדידת פעילות עצבית – רזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה, ללא צורך בכלים גנטיים – ומתגברת על מגבלות מרכזיות של טכניקת רישום החוד המסורתית.
Introduction
חרקים, כולל זבובי דרוזופילים, ניחנים במערכת טעם מתוחכמת המאפשרת להם לחלץ מידע כימי מורכב מסביבתם. מערכת זו מאפשרת להם להבחין בהרכב הכימי של חומרים שונים, תוך הבחנה בין אלה המזינים לבין אלה המזיקים 1,2.
בליבה של מערכת זו נמצאים מבנים מיוחדים המכונים שערות טעם או סנסילה, הממוקמים אסטרטגית על חלקי גוף שונים. בזבובים דרוזופיליים, סנסילה אלה ממוקמים על התווית, שהיא איבר הטעם העיקרי של ראש הזבוב 1,2,3,4, כמו גם על הרגליים והכנפיים 1,2,5,6. התווית ממוקמת בקצה החוטם ומכילה שתי אונות 4,7,8. כל אונה מכוסה ב-31 חושי טעם המסווגים כקצרים, ארוכים ובינוניים 4,7,8. כל סנסילה זו מאכלסת 2-4 נוירוני טעם 1,2,9,10. נוירוני הטעם האלה מבטאים חברים בלפחות ארבע משפחות גנים שונות, כלומר קולטן גוסטטורי (Gr), קולטן יונוטרופי (Ir), כייס (Ppk) וקולטן פוטנציאלי חולף (Trp) גנים 1,2,11,12,13 . מגוון זה של קולטנים ותעלות מצייד חרקים ביכולת לזהות מגוון רחב של תרכובות כימיות, כולל רמזים לא נדיפים ונדיפים 1,2,14.
במשך יותר מ-50 שנה, מדענים כימתו את התגובה של נוירוני טעם והקולטנים שלהם באמצעות שיטה שנקראת רישום קצה 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. עם זאת, שיטה זו יש מגבלות גדולות. ראשית, פעילות עצבית יכולה להימדד רק במהלך מגע עם הגירוי, ולא לפני או אחרי מגע. מגבלה זו מונעת מדידה של פעילות ספייקינג ספונטנית ומונעת מדידה של תגובות OFF. שנית, ניתן לבדוק רק טעמים מסיסים בתמיסות מימיות.
ניתן להתגבר על מגבלות אלה על ידי טכניקה אלקטרופיזיולוגית חלופית נדירה הנקראת “הקלטת בסיס”. כאן אנו מתארים טכניקה זו, שאימצנו משיטה שבה השתמשו מריון-פול ועמיתיה24, ומראים את תכונות קידוד הטעם המכריעות שהיא יכולה כעת למדוד בנוחות14.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהקלטות מסוגים מסוימים של סנסילה, זה יכול להיות מאתגר להבדיל בין קוצים של נוירונים שונים. לדוגמה, נוירוני הסוכר והנוירונים המכנו-סנסוריים של S ו-I sensilla מייצרים קוצים בעלי אמפליטודות דומות, מה שמקשה על ההבחנה ביניהם 4,14. אנו מוצאים כי השימוש באלקטרודת רישום טו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לזינה ברמן על התמיכה, לליסה באיק על ההערות על כתב היד, ולחברים אחרים במעבדת קרלסון על הדיון. עבודה זו נתמכה במענק K01 DC020145 של NIH ל-H.K.M.D; וה-NIH מעניק R01 DC02174, R01 DC04729 ו-R01 DC011697 ל-J.R.C.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
- Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
- Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
- Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
- Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
- Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
- Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
- Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
- Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
- Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
- Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
- Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
- Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
- Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
- Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
