Enregistrement de base : une technique d’analyse des réponses des neurones gustatifs chez la drosophile
Summary
Une méthode d’enregistrement électrophysiologique rarement utilisée, l’enregistrement de base, permet d’analyser des caractéristiques du codage du goût qui ne peuvent pas être examinées par les méthodes d’enregistrement conventionnelles. L’enregistrement de base permet également d’analyser les réponses gustatives à des stimuli hydrophobes qui ne peuvent pas être étudiés à l’aide des méthodes électrophysiologiques traditionnelles.
Abstract
Les insectes goûtent le monde extérieur à travers les poils gustatifs, ou sensilles, qui ont des pores à leurs extrémités. Lorsqu’un sensillum entre en contact avec une source de nourriture potentielle, les composés de la source de nourriture pénètrent par les pores et activent les neurones à l’intérieur. Depuis plus de 50 ans, ces réponses ont été enregistrées à l’aide d’une technique appelée enregistrement des pointes. Cependant, cette méthode présente des limites majeures, notamment l’incapacité de mesurer l’activité neuronale avant ou après le contact avec un stimulus et l’exigence que les arômes soient solubles dans les solutions aqueuses. Nous décrivons ici une technique que nous appelons enregistrement de base, qui permet de surmonter ces limitations. L’enregistrement de base permet de mesurer l’activité des neurones gustatifs avant, pendant et après le stimulus. Ainsi, il permet une analyse approfondie des réponses OFF qui se produisent après un stimulus gustatif. Il peut être utilisé pour étudier des composés hydrophobes tels que les phéromones à longue chaîne qui ont une très faible solubilité dans l’eau. En résumé, l’enregistrement de base offre les avantages de l’électrophysiologie monosensille comme moyen de mesurer l’activité neuronale – haute résolution spatiale et temporelle, sans avoir besoin d’outils génétiques – et surmonte les principales limites de la technique traditionnelle d’enregistrement des pointes.
Introduction
Les insectes, y compris les mouches drosophiles, sont dotés d’un système gustatif sophistiqué qui leur permet d’extraire des informations chimiques complexes de leur environnement. Ce système leur permet de discerner la composition chimique de diverses substances, en distinguant celles qui sont nutritives et celles qui sont nocives 1,2.
Au cœur de ce système se trouvent des structures spécialisées connues sous le nom de poils gustatifs ou sensilles, stratégiquement situées sur diverses parties du corps. Chez les mouches drosophiles, ces sensilles sont situées sur le labelle, qui est le principal organe gustatif de la tête de mouche 1,2,3,4, ainsi que sur les pattes et les ailes 1,2,5,6. Le labelle est situé à l’extrémité de la trompe et contient deux lobes4, 7 et 8. Chaque lobe est recouvert de 31 sensilles gustatives classées en courtes, longues et intermédiaires 4,7,8. Ces sensilles abritent chacune 2 à 4 neurones gustatifs1, 2, 9, 10. Ces neurones gustatifs expriment les membres d’au moins quatre familles de gènes différentes, à savoir les gènes 1,2,11,13 du récepteur gustatif (Gr), du récepteur ionotrope (Ir), du pickpocket (Ppk) et du potentiel de récepteur transitoire (Trp). Cette diversité de récepteurs et de canaux donne aux insectes la capacité de reconnaître un large éventail de composés chimiques, y compris les signaux non volatils et volatils 1,2,14.
Depuis plus de 50 ans, les scientifiques quantifient la réponse des neurones gustatifs et de leurs récepteurs à l’aide d’une technique appelée enregistrement des pointes 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Cependant, cette méthode présente des limites majeures. Tout d’abord, l’activité neuronale ne peut être mesurée que pendant le contact avec le stimulus, et non avant ou après le contact. Cette limitation empêche la mesure de l’activité de pic spontané et empêche la mesure des réponses OFF. Deuxièmement, seuls les arômes solubles dans les solutions aqueuses peuvent être testés.
Ces limitations peuvent être surmontées par une technique électrophysiologique alternative rarement utilisée appelée « enregistrement de base ». Nous décrivons ici cette technique, que nous avons adaptée d’une méthode utilisée par Marion-Poll et ses collègues24, et montrons les caractéristiques cruciales de codage du goût qu’elle peut maintenant mesurer commodément14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les enregistrements de certains types de sensilles, il peut être difficile de différencier les pointes de différents neurones. Par exemple, les neurones à sucre et les neurones mécanosensoriels des sensilles S et I produisent des pointes d’amplitudes similaires, ce qui rend difficile leur distinction 4,14. Nous constatons que l’utilisation d’une électrode d’enregistrement en tungstène très tranchante réduit l’activation du neurone mécanos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Zina Berman pour son soutien, Lisa Baik pour ses commentaires sur le manuscrit et les autres membres du laboratoire Carlson pour la discussion. Ce travail a été soutenu par la subvention NIH K01 DC020145 à H.K.M.D ; et le NIH accorde les DC02174 R01, R01 DC04729 et R01 DC011697 à J.R.C.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
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