Alveolar mukozal immün yanıtları incelemek için immünokompetan alveol-çip üzerinde model
Summary
Çip üzerinde akciğer modelleri, hava-sıvı arayüzünü ve endotel hücre perfüzyonunu taklit ederek, akciğer fizyolojisi çalışmaları için çok önemli olan kan akışını ve besin değişimini simüle ederek geleneksel 2D kültürleri aşıyor. Bu, solunum yolu enfeksiyonlarının anlaşılmasını ve tedavisini ilerletmek için dinamik, fizyolojik olarak doğru bir ortam sunarak akciğer araştırmalarının alaka düzeyini artırır.
Abstract
İnsan alveolar yapısını ve işlevini taklit etmek için tasarlanmış gelişmiş bir immün yetmezlikli çip üzerinde akciğer modelini tanıtıyoruz. Bu yenilikçi model, insan alveollerindeki ortamı taklit eden bir hava-sıvı arayüzünü destekleyen mikroakışkan perfüze bir biyoçip kullanır. Doku mühendisliği, alveollerin temsili bir doku modelini oluşturmak için endotel hücreleri, makrofajlar ve epitel hücreleri dahil olmak üzere temel hücresel bileşenleri entegre etmek için kullanılır. Model, virüsler, bakteriler ve mantarlar dahil olmak üzere çeşitli patojenlere karşı mukozal bağışıklık tepkilerinin derinlemesine incelenmesini kolaylaştırır ve böylece akciğer bağışıklığı anlayışımızı geliştirir. Bu protokolün birincil amacı, bu alveolün çip üzerinde modelini enfeksiyon çalışmaları için sağlam bir in vitro platform olarak kurmak için ayrıntılar sağlamak ve araştırmacıların pulmoner ortamda patojenler ve konakçının bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşimleri yakından gözlemlemelerini ve analiz etmelerini sağlamaktır. Bu, epitel hücrelerinin havaya gerçekçi bir şekilde maruz kalması için çok önemli olan bir hava-sıvı arayüzünün korunmasının yanı sıra, kan akışı ve endotel hücrelerinin biyomekanik stimülasyonu dahil olmak üzere insan alveollerinin temel fizyolojik koşullarını simüle etmek için mikroakışkan tabanlı tekniklerin uygulanmasıyla elde edilir. Model sistemi, immünofloresan boyama, sitokin profili oluşturma ve koloni oluşturan birim (CFU)/plak analizi gibi bir dizi standartlaştırılmış testle uyumludur ve enfeksiyon sırasında bağışıklık dinamikleri hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Çip üzerinde alveol, gözenekli polietilen tereftalat (PET) zarları ile ayrılmış insan distal akciğer epitel hücreleri (H441) ve insan göbek veni endotel hücreleri (HUVEC’ler) dahil olmak üzere temel hücre tiplerinden oluşur ve birincil monositten türetilmiş makrofajlar epitel ve endotel katmanları arasında stratejik olarak konumlandırılır. Doku modeli, in vitro pulmoner immün yanıtlarda yer alan nüanslı faktörleri inceleme ve analiz etme yeteneğini geliştirir. Değerli bir araç olarak, solunum yolu enfeksiyonlarının patogenezini incelemek ve potansiyel terapötik müdahaleleri test etmek için daha doğru ve dinamik bir in vitro model sağlayarak akciğer araştırmalarının ilerlemesine katkıda bulunmalıdır.
Introduction
İnsan akciğeri, alveolar mukozanın bağışıklık tepkileri arasındaki karmaşık etkileşimlerle solunum ve bağışıklık savunmasında dikkate değer bir role sahiptir1. Alveollerin etkili bir bağışıklık tepkisi oluşturma yeteneği, akciğer enfeksiyonlarını önlemek ve akciğer sağlığını güvence altına almak için hayati önem taşır. Akciğerler sürekli olarak bakteriler, virüsler, mantarlar, alerjiler ve partikül maddeler dahil olmak üzere çok çeşitli potansiyel risklere maruz kaldığından, alveolar mukozal immün yanıtların karmaşıklıklarını anlamak, solunum yolu enfeksiyonlarının, enflamatuar bozuklukların arkasındaki mekanizmaları keşfetmek ve pulmoner hastalıkların tedavisi için kritik öneme sahiptir1.
Solunum yollarının enfeksiyon ve inflamasyonla ilgili süreçlerini in vitro olarak incelemek için, alveolar ortamı ve immün yanıtları sadık bir şekilde taklit edebilecek modeller gereklidir. 2D hücre kültürü ve hayvan modülleri, akciğer bağışıklık tepkisi üzerine biyomedikal araştırmalar için temel araçlar olarak onlarca yıldır kullanılmaktadır. Bununla birlikte, genellikle insan durumlarına çeviri potansiyellerinde sınırlamaları vardır. Çip üzerinde akciğer modelleri, geleneksel in vitro ve in vivo modeller arasındaki boşluğu doldurmaya katkıda bulunabilir ve insana özgü bağışıklık tepkilerini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlayabilir 2,3. Çip üzerinde akciğer modelleri, akciğer hücrelerinin solunum yolunun fizyolojik koşullarını özetlemesi ve daha doğru ve sağlam bir doku modeli geliştirmesi için gerekli olan hava-sıvı arayüzünü taklit edebilir. Bu kültür tekniği, hücre farklılaşmasının, işleyişinin ve ilaçlara veya hastalıkla ilgili uyaranlara verilen yanıtların in vitro2 hassas bir şekilde incelenmesini sağlar.
Bu çalışmada, kan akışını taklit etmek için perfüzyon ve endotel hücrelerinin biyomekanik stimülasyonunu uygulayarak ve hava fazı4’e maruz kalan epitel hücreleri ile bir hava-sıvı arayüzü dahil ederek insan alveolünün mikroakışkan tabanlı bir modelini sunuyoruz. İnsan alveolünün fiziksel yapısını ve biyolojik etkileşimlerini taklit eden, özellikle hava-sıvı arayüzüne odaklanan mikroakışkan perfüze edilmiş bir çip üzerinde alveol geliştirdik. Bu arayüz, pulmoner ortamın doğru bir şekilde modellenmesi için gerekli olan solunum epitel hücrelerinin farklılaşmasında çok önemli bir rol oynar. Model, gözenekli polietilen tereftalat (PET) zarları ile ayrılan ve hücre katmanları arasına yerleştirilmiş birincil monosit türevi makrofajlar ile ayrılmış insan distal akciğer epitel hücreleri (H441) ve insan göbek veni endotel hücrelerini (HUVEC’ler) kullanır. Bu kurulum, alveolün karmaşık hücresel düzenlemesini kopyalar ve akciğer dokusunun fizyolojik işlevinde önemli bir faktör olan hava-sıvı arayüzünü doğru bir şekilde simüle etmek için kritik öneme sahiptir.
Model geliştirmenin arkasındaki mantık, hem dolaşımdaki hem de dokuda yerleşik bağışıklık hücrelerini entegre etmeye kadar uzanır. Bu yaklaşım, insan solunum yolu enfeksiyonlarına karşı inflamatuar konak yanıtını doğru bir şekilde taklit etmek ve patojen-konak etkileşimlerini incelemek için dinamik bir ortam sağlamak üzere tasarlanmıştır. Makrofajların varlığı, solunum yolu enfeksiyonlarına karşı ilk savunma hattını yansıtan ani bağışıklık tepkilerinin ve bunların patojenlerle etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Ayrıca, biyoçip platformunun tasarımı, alveol fonksiyonunu in vitro olarak çoğaltmak için çok önemli olan hem biyofiziksel hem de biyokimyasal ipuçlarının uygun ve hassas bir şekilde manipüle edilmesini kolaylaştırır. Bu esneklik, insan enfeksiyonlarına katkıda bulunan faktörlerin incelenmesinde, araştırmacıların çeşitli hastalık durumlarını yansıtacak şekilde koşulları ayarlamasına veya potansiyel terapötik müdahaleleri test etmesine olanak tanır. Platformun gelişmiş mikroskopi, mikrobiyolojik analizler ve biyokimyasal atık analizi dahil olmak üzere çoklu okuma teknolojileriyle uyumluluğu, faydasını artırır. Bu yetenekler, hücresel davranışın, patojen proliferasyonunun ve bağışıklık tepkilerinin etkinliğinin değerlendirilmesi dahil olmak üzere enfeksiyonlara doku yanıtının kapsamlı bir değerlendirmesine izin verir.
Hava-sıvı arayüzünü kopyalamaya ve insan enfeksiyonlarını in vitro olarak incelemek için bağışıklık hücrelerini entegre etmeye odaklanan bir çip üzerinde insan alveol modeli oluşturmak ve kullanmak için ayrıntılı bir protokol ve teknikler sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çip üzerinde alveol modeli, insan alveolünün çok katmanlı bir doku modelini temsil eder ve akciğer epitel hücreleri, endotel hücreleri ve makrofajlar dahil olmak üzere alt solunum yolunun temel hücre tiplerini entegre eder ve endotel astarının orta perfüzyonu ile bir ALI’de organotipik bir düzenlemede kültürlenir. Farklı katmanlardaki hücreler, hücreler arası epitel bariyerlerinin oluşturulmasında merkezi olan, akciğer epitel hücrelerinin kalsiyuma bağımlı bir adezyon molekülü olan E-kaderin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
H.K. ve A.S.M., Leibniz Derneği’nin Stratejik Ağı finansman hattı tarafından finanse edilen Leibniz Bilim Kampüsü InfectoOptics Jena’dan sağlanan finansmanı kabul etti. M.A. ve A.S.M., Federal Federal Meclis’in bir kararı temelinde Federal Ekonomi ve Enerji Bakanlığı tarafından finanse edilen IGF projesi IMPROVE tarafından desteklendi. A.S.M ayrıca, Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860 kapsamında Microverse Mükemmeliyet Dengesi Kümesi’nin mali desteğini de kabul etti.
Materials
| Consumables | ||
| Cellcounting chamber slides (Countess) | Invitrogen | C10283 |
| Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 |
| Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 |
| Coverslips (24x40mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 |
| Eco wipes | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI |
| Gauze swab | Noba | PZN 2417767 |
| Gloves Nitril 3000 | Meditrade | 1280 |
| Microscope slides | Menzel-Gläser | AAAA000001##12E |
| Multiwell Plates 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 |
| Pasteur pipettes (glass) 150mm | Assistent | 40567001 |
| Pasteur pipettes (glass) 230mm | Assistent | 40567002 |
| Round-bottom tubes (PS, 5mL) | Falcon | 352052 |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 |
| Scalpels | Dahlhausen | 11.000.00.715 |
| Serological pipettes 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI |
| Serological pipettes 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI |
| Serological pipettes 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI |
| Serological pipettes 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI |
| Serological pipettes 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 |
| Softasept N | Braun | 3887138 |
| T25 flask | Greiner Bio-One | 690 960 |
| Tips sterile 10µL | Greiner Bio-One | 771 261 |
| Tips sterile 1250µL | Greiner Bio-One | 750 261 |
| Tips sterile 300µL | Greiner Bio-One | 738 261 |
| Tips unsterile 10µL | Greiner Bio-One | 765 290 |
| Tips unsterile 1000µL | Greiner Bio-One | 739 291 |
| Tips unsterile 200µL | Greiner Bio-One | 686 290 |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 |
| Chemicals | ||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 |
| Ethanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 |
| Methanol | VWR | 20847.295 |
| Saponin | Fluka | 47036 |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 |
| Cell culture | ||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E788S |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 |
| Fetal bovine Serum | Sigma-Aldrich | E2129-10g |
| H441 | ATCC | |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 |
| Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 |
| RPMI | Gibco | 72400047 |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Primary antibodies | ||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat) | BD | 610252 |
| CD68 (rabbit) | CellSignaling | 76437 |
| E-Cadherin (goat) | R&D | AF748 |
| SP-A (mouse) | Abcam | ab51891 |
| Secondary antibodies | ||
| AF488 (donkey anti mouse) | Invitrogen | R37114 |
| AF647 (donkey anti mouse) | invitrogen | A31571 |
| AF647 (donkey anti rabbit) | Invitrogen | A31573 |
| Cy3 (donkey anti goat) | jackson research | 705-165-147 |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 |
| Microfluidic | ||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 |
| Male Luer Lock (small) | ChipShop | 09-0503-0270-09 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, green | Microfluidic chipshop | 09-0558-0336-11 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, red | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 |
| Reservoir 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 |
| Equipment | ||
| Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 |
| Flowcytometer | BD | FACS Canto II |
| Freezer (-20 °C) | Liebherr | LCexv 4010 |
| Freezer (-80 °C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 |
| Fridge | Liebherr | LCexv 4010 |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R |
| Microscope | Leica | DM IL LED |
| Orbital shaker | Heidolph | Reax2000 |
| Peristaltic pump | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D |
| Pipettes 10µL | Eppendorf Research plus | 3123000020 |
| Pipettes 100µL | Eppendorf Research plus | 3123000047 |
| Pipettes 1000µL | Eppendorf Research plus | 3123000063 |
| Pipettes 2.5µL | Eppendorf Research plus | 3123000012 |
| Pipettes 20µL | Eppendorf Research plus | 3123000039 |
| Pipettes 200µL | Eppendorf Research plus | 3123000055 |
| Scale | Sartorius | 6101 |
| Scale | Sartorius | TE1245 |
| Sterile bench | Kojair | Biowizard SL-130 |
| Waterbath | Julabo | SW-20C |
| Fluorescence Microscope Setup | ||
| Apotome.2 | Zeiss | |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 |
| Software | ||
| ZEN Blue Edition | Zeiss |
References
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351 (2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012 (2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577 (2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420 (2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227 (2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
