نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة المناعي لدراسة الاستجابات المناعية المخاطية السنخية
Summary
نماذج الرئة على رقاقة تتجاوز الثقافات التقليدية 2D من خلال محاكاة واجهة الهواء السائل ونضح الخلايا البطانية، ومحاكاة تدفق الدم وتبادل المغذيات حاسمة لدراسات فسيولوجيا الرئة. هذا يعزز أهمية أبحاث الرئة ، ويوفر بيئة ديناميكية ودقيقة من الناحية الفسيولوجية لتعزيز فهم وعلاج التهابات الجهاز التنفسي.
Abstract
نقدم نموذجا متقدما للرئة على الرقاقة ذات الكفاءة المناعية مصمما لتكرار البنية السنخية البشرية ووظيفتها. يستخدم هذا النموذج المبتكر رقاقة حيوية ذات موائع دقيقة تدعم واجهة الهواء والسائل التي تحاكي البيئة في الحويصلات الهوائية البشرية. تستخدم هندسة الأنسجة لدمج المكونات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك الخلايا البطانية والبلاعم والخلايا الظهارية ، لإنشاء نموذج نسيجي تمثيلي للحويصلات الهوائية. يسهل النموذج إجراء فحوصات متعمقة للاستجابات المناعية المخاطية لمسببات الأمراض المختلفة ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والفطريات ، وبالتالي تعزيز فهمنا لمناعة الرئة. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير تفاصيل لإنشاء نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة كمنصة قوية في المختبر لدراسات العدوى ، مما يمكن الباحثين من مراقبة وتحليل التفاعلات المعقدة بين مسببات الأمراض والجهاز المناعي للمضيف داخل البيئة الرئوية عن كثب. يتم تحقيق ذلك من خلال تطبيق التقنيات القائمة على الموائع الدقيقة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية الرئيسية للحويصلات الهوائية البشرية ، بما في ذلك تدفق الدم والتحفيز الميكانيكي الحيوي للخلايا البطانية ، إلى جانب الحفاظ على واجهة الهواء والسائل الضرورية للتعرض الواقعي للخلايا الظهارية للهواء. يتوافق النظام النموذجي مع مجموعة من المقايسات الموحدة ، مثل تلطيخ التألق المناعي ، وتوصيف السيتوكين ، وتحليل وحدة تكوين المستعمرات (CFU) / اللويحات ، مما يسمح برؤى شاملة لديناميكيات المناعة أثناء العدوى. تتكون الحويصلات الهوائية على الرقاقة من أنواع الخلايا الأساسية ، بما في ذلك الخلايا الظهارية الرئوية البشرية البعيدة (H441) والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) مفصولة بأغشية البولي إيثيلين تيريفثاليت المسامية (PET) ، مع وجود بلاعم أولية مشتقة من الخلايا الوحيدة في وضع استراتيجي بين الطبقات الظهارية والبطانية. يعزز نموذج الأنسجة القدرة على تشريح وتحليل العوامل الدقيقة التي تنطوي عليها الاستجابات المناعية الرئوية في المختبر. كأداة قيمة ، يجب أن تساهم في تقدم أبحاث الرئة ، وتوفير نموذج أكثر دقة وديناميكية في المختبر لدراسة التسبب في التهابات الجهاز التنفسي واختبار التدخلات العلاجية المحتملة.
Introduction
تلعب الرئة البشرية دورا ملحوظا في التنفس والدفاع المناعي ، مع تفاعلات معقدة بين الاستجابات المناعية للغشاء المخاطي السنخي1. تعد قدرة الحويصلات الهوائية على خلق استجابة مناعية فعالة أمرا حيويا للوقاية من التهابات الرئة وتأمين الصحة الرئوية. نظرا لأن الرئتين تتعرض باستمرار لمجموعة واسعة من المخاطر المحتملة ، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والفطريات والحساسية والجسيمات ، فإن فهم تعقيدات الاستجابات المناعية المخاطية السنخية أمر بالغ الأهمية لاكتشاف الآليات الكامنة وراء التهابات الجهاز التنفسي والاضطرابات الالتهابية وعلاج الأمراض الرئوية1.
لدراسة العدوى والعمليات المرتبطة بالالتهاب في الجهاز التنفسي في المختبر ، هناك حاجة إلى نماذج يمكن أن تحاكي بأمانة الوسط السنخي والاستجابات المناعية. وقد استخدمت 2D ثقافة الخلايا والوحدات الحيوانية لعقود من الزمن كأدوات أساسية للبحوث الطبية الحيوية على الاستجابة المناعية للرئة. ومع ذلك ، غالبا ما يكون لديهم قيود في إمكاناتهم الانتقالية للمواقف البشرية. يمكن أن تساهم نماذج الرئة على الرقاقة في سد الفجوة بين النماذج التقليدية في المختبر وفي الجسم الحي وتوفر نهجا جديدا لدراسة الاستجابات المناعية الخاصة بالإنسان 2,3. يمكن لنماذج الرئة على الرقاقة أن تحاكي واجهة الهواء والسائل ، وهو أمر مطلوب لخلايا الرئة لتلخيص الظروف الفسيولوجية للجهاز التنفسي وتطوير نموذج أنسجة أكثر دقة وقوة. تتيح تقنية المزرعة هذه فحصا دقيقا لتمايز الخلايا وعملها واستجاباتها للأدوية أو المحفزات المرتبطة بالأمراض في المختبر2.
في هذه الدراسة ، نقدم نموذجا قائما على الموائع الدقيقة للحويصلات الهوائية البشرية كأداة فعالة لتلخيص الوسط السنخي البشري من خلال تطبيق التروية لتقليد تدفق الدم والتحفيز الميكانيكي الحيوي للخلايا البطانية ودمج واجهة الهواء السائل مع الخلايا الظهارية المعرضة نحو مرحلة الهواء4. لقد قمنا بتطوير الحويصلات الهوائية ذات الموائع الدقيقة على الرقاقة التي تحاكي البنية الفيزيائية والتفاعلات البيولوجية للحويصلات الهوائية البشرية ، مع التركيز بشكل خاص على واجهة الهواء والسائل. تلعب هذه الواجهة دورا حاسما في تمايز الخلايا الظهارية التنفسية ، وهو أمر ضروري لنمذجة البيئة الرئوية بدقة. يستخدم النموذج الخلايا الظهارية الرئوية البشرية البعيدة (H441) والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) ، مفصولة بأغشية البولي إيثيلين تيريفثاليت المسامية (PET) ، مع وضع البلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الوحيدة بين طبقات الخلايا. يكرر هذا الإعداد الترتيب الخلوي المعقد للحويصلات الهوائية وهو أمر بالغ الأهمية لمحاكاة واجهة الهواء والسائل بدقة ، وهو عامل مهم في الوظيفة الفسيولوجية لأنسجة الرئة.
يمتد الأساس المنطقي وراء تطوير النموذج إلى دمج كل من الخلايا المناعية المنتشرة والمقيمة في الأنسجة. تم تصميم هذا النهج لمحاكاة استجابة المضيف الالتهابية بدقة لالتهابات الجهاز التنفسي البشرية ، مما يوفر بيئة ديناميكية لدراسة التفاعلات بين العامل الممرض والمضيف. يسمح وجود الضامة بفحص الاستجابات المناعية الفورية وتفاعلها مع مسببات الأمراض ، مما يعكس خط الدفاع الأول ضد التهابات الجهاز التنفسي. علاوة على ذلك ، يسهل تصميم منصة الرقاقة الحيوية المعالجة المريحة والدقيقة لكل من الإشارات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتكرار وظيفة الحويصلات الهوائية في المختبر. هذه المرونة مفيدة في تشريح العوامل المساهمة في العدوى البشرية ، مما يمكن الباحثين من تعديل الظروف لتعكس حالات المرض المختلفة أو لاختبار التدخلات العلاجية المحتملة. إن توافق المنصة مع تقنيات القراءة المتعددة ، بما في ذلك الفحص المجهري المتقدم والتحليلات الميكروبيولوجية وتحليل النفايات السائلة الكيميائية الحيوية ، يعزز فائدتها. تسمح هذه القدرات بإجراء تقييم شامل لاستجابة الأنسجة للعدوى ، بما في ذلك تقييم السلوك الخلوي ، وانتشار مسببات الأمراض ، وفعالية الاستجابات المناعية.
نقدم بروتوكولا وتقنيات مفصلة لإنشاء واستخدام نموذج الحويصلات الهوائية البشرية على الرقاقة الذي يركز على تكرار واجهة الهواء السائل ودمج الخلايا المناعية لدراسة العدوى البشرية في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمثل نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة نموذجا نسيجيا متعدد الطبقات للحويصلات الهوائية البشرية ، يدمج أنواع الخلايا الأساسية في الجهاز التنفسي السفلي ، بما في ذلك الخلايا الظهارية الرئوية والخلايا البطانية والبلاعم ، المزروعة بترتيب عضوي في ALI مع نضح متوسط للبطانة البطانية. تعبر خلاي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر H.K. و A.S.M. بالتمويل المقدم من Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena ، بتمويل من خط التمويل الشبكات الاستراتيجية لجمعية Leibniz. تم دعم MA و A.S.M. من قبل مشروع IMPROVE لمنتدى إدارة الإنترنت بتمويل من الوزارة الاتحادية للشؤون الاقتصادية والطاقة على أساس قرار من البوندستاغ الألماني. كما تقر A.S.M بالدعم المالي المقدم من مجموعة توازن التميز في Microverse في إطار استراتيجية التميز الألمانية – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860.
Materials
| Consumables | ||
| Cellcounting chamber slides (Countess) | Invitrogen | C10283 |
| Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 |
| Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 |
| Coverslips (24x40mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 |
| Eco wipes | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI |
| Gauze swab | Noba | PZN 2417767 |
| Gloves Nitril 3000 | Meditrade | 1280 |
| Microscope slides | Menzel-Gläser | AAAA000001##12E |
| Multiwell Plates 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 |
| Pasteur pipettes (glass) 150mm | Assistent | 40567001 |
| Pasteur pipettes (glass) 230mm | Assistent | 40567002 |
| Round-bottom tubes (PS, 5mL) | Falcon | 352052 |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 |
| Scalpels | Dahlhausen | 11.000.00.715 |
| Serological pipettes 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI |
| Serological pipettes 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI |
| Serological pipettes 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI |
| Serological pipettes 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI |
| Serological pipettes 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 |
| Softasept N | Braun | 3887138 |
| T25 flask | Greiner Bio-One | 690 960 |
| Tips sterile 10µL | Greiner Bio-One | 771 261 |
| Tips sterile 1250µL | Greiner Bio-One | 750 261 |
| Tips sterile 300µL | Greiner Bio-One | 738 261 |
| Tips unsterile 10µL | Greiner Bio-One | 765 290 |
| Tips unsterile 1000µL | Greiner Bio-One | 739 291 |
| Tips unsterile 200µL | Greiner Bio-One | 686 290 |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 |
| Chemicals | ||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 |
| Ethanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 |
| Methanol | VWR | 20847.295 |
| Saponin | Fluka | 47036 |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 |
| Cell culture | ||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E788S |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 |
| Fetal bovine Serum | Sigma-Aldrich | E2129-10g |
| H441 | ATCC | |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 |
| Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 |
| RPMI | Gibco | 72400047 |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Primary antibodies | ||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat) | BD | 610252 |
| CD68 (rabbit) | CellSignaling | 76437 |
| E-Cadherin (goat) | R&D | AF748 |
| SP-A (mouse) | Abcam | ab51891 |
| Secondary antibodies | ||
| AF488 (donkey anti mouse) | Invitrogen | R37114 |
| AF647 (donkey anti mouse) | invitrogen | A31571 |
| AF647 (donkey anti rabbit) | Invitrogen | A31573 |
| Cy3 (donkey anti goat) | jackson research | 705-165-147 |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 |
| Microfluidic | ||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 |
| Male Luer Lock (small) | ChipShop | 09-0503-0270-09 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, green | Microfluidic chipshop | 09-0558-0336-11 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, red | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 |
| Reservoir 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 |
| Equipment | ||
| Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 |
| Flowcytometer | BD | FACS Canto II |
| Freezer (-20 °C) | Liebherr | LCexv 4010 |
| Freezer (-80 °C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 |
| Fridge | Liebherr | LCexv 4010 |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R |
| Microscope | Leica | DM IL LED |
| Orbital shaker | Heidolph | Reax2000 |
| Peristaltic pump | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D |
| Pipettes 10µL | Eppendorf Research plus | 3123000020 |
| Pipettes 100µL | Eppendorf Research plus | 3123000047 |
| Pipettes 1000µL | Eppendorf Research plus | 3123000063 |
| Pipettes 2.5µL | Eppendorf Research plus | 3123000012 |
| Pipettes 20µL | Eppendorf Research plus | 3123000039 |
| Pipettes 200µL | Eppendorf Research plus | 3123000055 |
| Scale | Sartorius | 6101 |
| Scale | Sartorius | TE1245 |
| Sterile bench | Kojair | Biowizard SL-130 |
| Waterbath | Julabo | SW-20C |
| Fluorescence Microscope Setup | ||
| Apotome.2 | Zeiss | |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 |
| Software | ||
| ZEN Blue Edition | Zeiss |
References
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351 (2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012 (2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577 (2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420 (2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227 (2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
