UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーのハイスループット構築のためのCRISPRベースのモジュラーアセンブリ
Summary
本稿では、一般に公開されているcDNA/ORFリソースを用いて ショウジョウバエ のUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリをハイスループットで構築する方法であるCRISPRベースのモジュラーアセンブリ(CRISPRmass)のプロトコールを紹介します。CRISPRmassは、さまざまなプラスミドライブラリーの編集に適用できます。
Abstract
機能ゲノミクススクリーニングは、遺伝子機能を調べるための強力なアプローチを提供し、ゲノムワイドなプラスミドライブラリの構築に依存しています。プラスミドライブラリー構築のための従来のアプローチは、時間と手間がかかります。そこで、私たちは最近、ゲノムワイドなアップストリーム活性化配列相補型DNA/オープンリーディングフレーム(UAS-cDNA/ORF)プラスミドライブラリーをハイスループットに構築するための、シンプルで効率的な方法であるCRISPRベースのモジュラーアセンブリ(CRISPRmass)を開発しました。ここでは、GAL4/UASベースのUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーの構築を例に、CRISPRmassのプロトコールを紹介します。このプロトコルには、超並列の2段階試験管反応とそれに続く細菌の形質転換が含まれます。最初のステップは、CRISPR/Cas9を使用してcDNAまたはORFの5’末端に隣接する共有アップストリームベクター配列をシングルガイドRNA(sgRNA)と一緒に切断することにより、既存の相補的DNA(cDNA)またはオープンリーディングフレーム(ORF)cDNAまたはORFライブラリプラスミドを直鎖化することです。また、次のステップは、シングルステップ反応を使用して、直鎖化されたcDNAまたはORFプラスミドにUASモジュールを挿入することです。CRISPRmassは、さまざまなプラスミドライブラリーをシンプル、迅速、効率的、かつ費用対効果の高い方法で構築することができます。UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーは、培養細胞における機能獲得スクリーニングや 、ショウジョウバエにおけるゲノムワイドなトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーの構築に利用できます。
Introduction
バイアスのない全ゲノム遺伝子スクリーニングは、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子を特定し、そのメカニズムを解明するための強力なアプローチです。したがって、それは生物学研究のさまざまな分野で広く使用されています。ショウジョウバエの遺伝子の約60%はヒト1,2に保存されており、ヒトの疾患遺伝子の~75%はショウジョウバエ3で相同体を持っています。遺伝子スクリーニングは、主に機能喪失(LOF)と機能獲得(GOF)の2種類に分けられます。ショウジョウバエのLOF遺伝子スクリーニングは、生物学のほぼすべての側面を支配するメカニズムを解明する上で重要な役割を果たしてきました。しかし、ショウジョウバエの遺伝子の大部分は明らかなLOF表現型を持っていないため4、したがって、GOFスクリーニングはこれらの遺伝子の機能を研究するための重要な方法です4,5。
バイナリGAL4/UASシステムは、 ショウジョウバエ6の組織特異的遺伝子発現に一般的に使用されます。このシステムでは、組織は、GAL4応答性要素(UAS)に結合する酵母転写活性化因子GAL4を特異的に発現し、それによって下流の遺伝成分(例えば、cDNAおよびORF)の転写を活性化します6。 ショウジョウバエでゲノムワイドなGOFスクリーニングを行うためには、ゲノムワイドなUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーを構築し、続いて ショウジョウバエにトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーを構築する必要があります。
一般に入手可能なcDNA/ORFクローンから従来の方法によるゲノムワイドなUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーの構築は、プライマーの設計と合成、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ゲル精製、シーケンシング、制限消化など、すべての遺伝子が個別の設計を必要とするため、時間と労力を要します7,8.したがって、このようなプラスミドライブラリーの構築は、ショウジョウバエにおけるゲノムワイドなトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーを作製するための律速ステップとなります。最近、私たちは新しい方法であるCRISPRベースのモジュラーアセンブリ(CRISPRmass)を開発することにより、この問題を解決することに成功しました9。CRISPRmassの中核は、遺伝子編集技術とシームレスクローニング技術の組み合わせにより、プラスミドライブラリーの共有ベクター配列を操作することです。
ここでは、超並列の2ステップ試験管反応とそれに続く細菌の形質転換を含むCRISPRmassのプロトコールを紹介します。CRISPRmass は、シンプルで、迅速、効率的、かつ費用対効果の高い方法であり、原則として、さまざまなプラスミドライブラリのハイスループット構築に使用できます。
CRISPR質量戦略
CRISPRmass の手順は、 大腸菌 (E. coli) 形質転換前の並列 2 段階試験管反応から始まります (図 1)。ステップ1は、Cas9/sgRNAによるcDNA/ORFプラスミドの同一のベクターバックボーンの切断です。理想的な切断部位は、cDNA/ORFの5’末端に隣接しています。劈開産物は精製する必要はありません。ステップ2は、GibsonアセンブリによりCas9/sgRNA直鎖状cDNA/ORFプラスミドにベクター特異的なUASモジュールを挿入(以下、シングルステップ反応と呼ぶ)することで、UAS-cDNA/ORFプラスミドを作製します。UASモジュールの5’末端配列と3’末端配列は、直鎖状化されたcDNA/ORFプラスミドの末端配列と重なり、シングルステップ反応を可能にします。
シングルステップ反応生成物は、 大腸菌 の形質転換に直接さらされます。理論的には、UASモジュールの抗生物質耐性遺伝子に対応する選択抗生物質を含むLuria-Bertani(LB)プレート上で成長できるのは、目的のUAS-cDNA/ORFコロニーのみです。UASモジュールは、コアUASモジュール、cDNAまたはORFプラスミドとは異なる抗生物質耐性遺伝子、および5′および3′末端配列で構成されています。コアUASモジュールは、UASの10コピー、Hsp70最小プロモーター、phiC31を介したゲノム統合のattB配列、 およびショウジョウバエ7のミニホワイト形質転換マーカーで構成されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPRmassの最も重要なステップは、sgRNAの設計とsgRNAの評価です。Cas9用の高効率sgRNAの選択は、CRISPRmassの成功の鍵です。大腸菌をシングルステップ反応集合産物で形質転換した後、抗生物質含有LBプレートの大部分でコロニーがほとんどまたはまったく観察されない場合は、アガロースゲル電気泳動によるプラスミド消化を確認してください。プラスミドが十分に消化されない場合は、Cas9活性?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(32071135および31471010)、上海浦江プログラム(14PJ1405900)、上海自然科学基金会(19ZR1446400)によって後援されました。
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
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