Montagem modular baseada em CRISPR para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF

A triagem genética imparcial do genoma completo é uma abordagem poderosa para identificar genes envolvidos em um determinado processo biológico e elucidar seu mecanismo. Portanto, é amplamente utilizado em vários campos da pesquisa biológica. Aproximadamente 60% dos genes de Drosophila são conservados em humanos ^1,2 e ~ 75% dos genes de doenças humanas têm homólogos em Drosophila³. A triagem genética é dividida principalmente em dois tipos: perda de função (LOF) e ganho de função (GOF). As telas genéticas LOF em Drosophila desempenharam um papel crítico na elucidação de mecanismos que governam quase todos os aspectos da biologia. No entanto, a maioria dos genes de Drosophila não possui fenótipos LOF^{óbvios 4} e, portanto, a triagem GOF é um método importante para estudar a função desses genes ^4,5.

O sistema binário GAL4 / UAS é comumente usado para expressão gênica específica do tecido em Drosophila⁶. Nesse sistema, o tecido expressa especificamente o ativador de transcrição de levedura GAL4 que se liga ao elemento responsivo GAL4 (UAS) e, assim, ativa a transcrição dos componentes genéticos a jusante (por exemplo, cDNA e ORF) ⁶ . Para realizar triagens GOF em todo o genoma em Drosophila, precisamos construir uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma e, posteriormente, uma biblioteca transgênica de UAS-cDNA/ORF em Drosophila.

A construção de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma por métodos convencionais a partir de clones de cDNA/ORF disponíveis publicamente é demorada e trabalhosa, pois cada gene requer projetos individualizados, incluindo design e síntese de primers, reação em cadeia da polimerase (PCR) e purificação em gel, sequenciamento, digestão de restrição e assim por diante ^7,8. Portanto, a construção de tal biblioteca de plasmídeos é uma etapa limitante da taxa na criação de uma biblioteca transgênica UAS-cDNA / ORF em todo o genoma em Drosophila. Recentemente, resolvemos com sucesso esse problema desenvolvendo um novo método, a montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass)⁹. O núcleo do CRISPRmass é manipular as sequências vetoriais compartilhadas de uma biblioteca de plasmídeos por meio de uma combinação de tecnologia de edição de genes e tecnologia de clonagem contínua.

Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRmass, que inclui reações massivamente paralelas em tubos de ensaio de duas etapas seguidas de transformação bacteriana. O CRISPRmass é um método simples, rápido, eficiente e econômico que, em princípio, pode ser usado para a construção de alto rendimento de várias bibliotecas de plasmídeos.

Estratégia CRISPRmass
O procedimento de CRISPRmass começa com reações paralelas em tubo de ensaio de duas etapas antes da transformação de Escherichia coli (E. coli) (Figura 1). A etapa 1 é a clivagem dos esqueletos vetoriais idênticos dos plasmídeos cDNA / ORF por Cas9 / sgRNA. Um local de clivagem ideal é adjacente à extremidade 5 ‘do cDNA / ORF. Os produtos de clivagem não precisam ser purificados. A etapa 2 é a inserção de um módulo UAS específico do vetor nos plasmídeos linearizados de cDNA/ORF Cas9/sgRNA pela montagem de Gibson (doravante denominada reação de etapa única), resultando em plasmídeos UAS-cDNA/ORF. As sequências terminais 5 ‘e 3’ de um módulo UAS se sobrepõem às dos plasmídeos cDNA / ORF linearizados, permitindo a reação de etapa única.

Os produtos de reação de etapa única são diretamente submetidos à transformação de E. coli . Teoricamente, apenas as colônias UAS-cDNA/ORF desejadas podem crescer em placas Luria-Bertani (LB) que contêm antibióticos de seleção correspondentes ao gene de resistência a antibióticos do módulo UAS. O módulo UAS é composto por um módulo UAS central, um gene de resistência a antibióticos distinto daquele dos plasmídeos cDNA ou ORF e as sequências terminais 5 ‘e 3’. Um módulo UAS central compreende 10 cópias de UAS, um promotor mínimo de Hsp70, uma sequência attB para integração genômica mediada por phiC31 e um marcador de transformação mini-branco para Drosophila⁷.