CRISPR-basierter modularer Aufbau für den Hochdurchsatzaufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek
Summary
Wir stellen ein Protokoll für die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass) vor, eine Methode zum Hochdurchsatzaufbau von UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliotheken in Drosophila unter Verwendung öffentlich verfügbarer cDNA/ORF-Ressourcen. CRISPRmass kann zur Bearbeitung verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden.
Abstract
Das funktionelle Genomik-Screening bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion und stützt sich auf den Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken. Herkömmliche Ansätze für den Aufbau von Plasmidbibliotheken sind zeitaufwändig und mühsam. Aus diesem Grund haben wir kürzlich eine einfache und effiziente Methode, die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass), für den Hochdurchsatzaufbau einer genomweiten Upstream-aktivierenden sequenzkomplementären DNA/Open Reading Frame (UAS-cDNA/ORF) Plasmidbibliothek entwickelt. Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRmass vor, am Beispiel des Aufbaus einer GAL4/UAS-basierten UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek. Das Protokoll umfasst massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen, gefolgt von einer bakteriellen Transformation. Der erste Schritt besteht darin, die vorhandenen komplementären DNA- (cDNA) oder Open Reading Frame (ORF)-cDNA- oder ORF-Bibliotheksplasmide zu linearisieren, indem die gemeinsam genutzten Upstream-Vektorsequenzen neben dem 5′-Ende von cDNAs oder ORFs unter Verwendung von CRISPR/Cas9 zusammen mit Single-Guide-RNA (sgRNA) geschnitten werden, und der zweite Schritt besteht darin, ein UAS-Modul in die linearisierten cDNA- oder ORF-Plasmide mit einer einstufigen Reaktion einzufügen. CRISPRmass ermöglicht den einfachen, schnellen, effizienten und kostengünstigen Aufbau verschiedener Plasmidbibliotheken. Die UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek kann für das Gain-of-Function-Screening in kultivierten Zellen und für den Aufbau einer genomweiten transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila verwendet werden.
Introduction
Das unvoreingenommene genetische Screening des gesamten Genoms ist ein leistungsfähiger Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an einem bestimmten biologischen Prozess beteiligt sind, und seinen Mechanismus aufzuklären. Daher ist es in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung weit verbreitet. Ungefähr 60% der Drosophila-Gene sind beim Menschen konserviert 1,2, und ~75% der menschlichen Krankheitsgene haben Homologe in Drosophila3. Das genetische Screening wird hauptsächlich in zwei Arten unterteilt: Funktionsverlust (LOF) und Funktionsgewinn (GOF). LOF-Genetic Screens in Drosophila haben eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung von Mechanismen gespielt, die fast jeden Aspekt der Biologie steuern. Die Mehrzahl der Drosophila-Gene weist jedoch keine offensichtlichen LOF-Phänotypenauf 4, und daher ist das GOF-Screening eine wichtige Methode, um die Funktion dieser Gene zu untersuchen 4,5.
Das binäre GAL4/UAS-System wird häufig für die gewebespezifische Genexpression in Drosophila6 verwendet. In diesem System exprimiert das Gewebe spezifisch den Hefetranskriptionsaktivator GAL4, der an das GAL4-responsive Element (UAS) bindet und dadurch die Transkription der nachgeschalteten genetischen Komponenten (z. B. cDNA und ORF) aktiviert6. Um genomweite GOF-Screenings in Drosophila durchführen zu können, müssen wir eine genomweite UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek und anschließend eine transgene UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila konstruieren.
Der Aufbau einer genomweiten UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek mit herkömmlichen Methoden aus öffentlich zugänglichen cDNA/ORF-Klonen ist zeitaufwändig und mühsam, da jedes Gen ein individuelles Design erfordert, einschließlich Primerdesign und -synthese, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelreinigung, Sequenzierung, Restriktionsverdau usw. 7,8. Daher ist der Aufbau einer solchen Plasmidbibliothek ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt bei der Erstellung einer genomweiten transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila. Vor kurzem haben wir dieses Problem erfolgreich gelöst, indem wir eine neuartige Methode entwickelt haben, die CRISPR-basierte modulare Anordnung (CRISPRmass)9. Der Kern von CRISPRmass besteht darin, die gemeinsam genutzten Vektorsequenzen einer Plasmidbibliothek durch eine Kombination aus Gen-Editing-Technologie und nahtloser Klonierungstechnologie zu manipulieren.
Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRmass vor, das massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen mit anschließender bakterieller Transformation umfasst. CRISPRmass ist eine einfache, schnelle, effiziente und kostengünstige Methode, die prinzipiell für den Hochdurchsatzaufbau verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden kann.
CRISPRmass-Strategie
Das Verfahren von CRISPRmass beginnt mit parallelen zweistufigen Reagenzglasreaktionen vor der Transformation von Escherichia coli (E. coli) (Abbildung 1). Schritt 1 ist die Spaltung der identischen Vektorrückgrate der cDNA/ORF-Plasmide durch Cas9/sgRNA. Eine ideale Spaltstelle befindet sich neben dem 5′-Ende der cDNA/ORF. Die Spaltprodukte müssen nicht gereinigt werden. Schritt 2 ist das Einfügen eines vektorspezifischen UAS-Moduls in die Cas9/sgRNA-linearisierten cDNA/ORF-Plasmide durch Gibson-Assemblierung (im Folgenden als Einzelschrittreaktion bezeichnet), was zu UAS-cDNA/ORF-Plasmiden führt. Die 5′- und 3′-terminalen Sequenzen eines UAS-Moduls überlappen sich mit denen der linearisierten cDNA/ORF-Plasmide, was die einstufige Reaktion ermöglicht.
Die einstufigen Reaktionsprodukte werden direkt der E. coli-Transformation unterzogen. Theoretisch können auf Luria-Bertani (LB)-Platten nur die gewünschten UAS-cDNA/ORF-Kolonien wachsen, die Selektionsantibiotika enthalten, die dem Antibiotikaresistenzgen des UAS-Moduls entsprechen. Das UAS-Modul besteht aus einem UAS-Kernmodul, einem Antibiotikaresistenzgen, das sich von dem der cDNA- oder ORF-Plasmide unterscheidet, und den 5′- und 3′-terminalen Sequenzen. Ein UAS-Kernmodul besteht aus 10 UAS-Kopien, einem Hsp70-Minimalpromotor, einer attB-Sequenz für die phiC31-vermittelte genomische Integration und einem Mini-White-Transformationsmarker für Drosophila7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kritischsten Schritte von CRISPRmass sind das Design von sgRNAs und die Evaluierung von sgRNAs. Die Auswahl hocheffizienter sgRNAs für Cas9 ist der Schlüssel zum Erfolg von CRISPRmass. Wenn auf der Mehrzahl der antibiotikahaltigen LB-Platten nach der Transformation von E. coli mit einstufigen Reaktionsassemblierungsprodukten nur sehr wenige oder keine Kolonien beobachtet werden, ist der Plasmidverdau durch Agarosegelelektrophorese zu überprüfen. Wenn Plasmide nicht gut verdaut werden, überprüfen Sie die Cas9-Ak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32071135 und 31471010), dem Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) und der Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400) gesponsert.
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
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