UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli yapısı için CRISPR tabanlı modüler montaj
Summary
Halka açık cDNA/ORF kaynaklarını kullanarak Drosophila’daki UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli inşası için bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass) için bir protokol sunuyoruz. CRISPRmass, çeşitli plazmit kütüphanelerini düzenlemek için uygulanabilir.
Abstract
Fonksiyonel genomik tarama, gen fonksiyonunu araştırmak için güçlü bir yaklaşım sunar ve genom çapında plazmit kütüphanelerinin oluşturulmasına dayanır. Plazmid kütüphanesi yapımı için geleneksel yaklaşımlar zaman alıcı ve zahmetlidir. Bu nedenle, yakın zamanda, genom çapında bir yukarı akış aktive edici dizi tamamlayıcı DNA/açık okuma çerçevesi (UAS-cDNA/ORF) plazmit kütüphanesinin yüksek verimli inşası için basit ve verimli bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass) geliştirdik. Burada, GAL4 / UAS tabanlı bir UAS-cDNA / ORF plazmit kütüphanesinin yapısını örnek alarak CRISPRmass için bir protokol sunuyoruz. Protokol, büyük ölçüde paralel iki aşamalı test tüpü reaksiyonlarını ve ardından bakteriyel dönüşümü içerir. İlk adım, tek kılavuz RNA (sgRNA) ile birlikte CRISPR/Cas9 kullanarak cDNA’ların veya ORF’lerin 5′ ucuna bitişik paylaşılan yukarı akış vektör dizilerini keserek mevcut tamamlayıcı DNA (cDNA) veya açık okuma çerçevesi (ORF) cDNA veya ORF kütüphane plazmitlerini doğrusallaştırmaktır ve ikinci adım, tek adımlı bir reaksiyon kullanarak doğrusallaştırılmış cDNA veya ORF plazmitlerine bir UAS modülü yerleştirmektir. CRISPRmass, çeşitli plazmit kütüphanelerinin basit, hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir şekilde oluşturulmasını sağlar. UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesi, kültürlenmiş hücrelerde fonksiyon kazancı taraması ve Drosophila’da genom çapında bir transgenik UAS-cDNA/ORF kütüphanesi oluşturmak için kullanılabilir.
Introduction
Tarafsız tüm genom genetik taraması, belirli bir biyolojik süreçte yer alan genleri tanımlamak ve mekanizmasını aydınlatmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu nedenle, biyolojik araştırmaların çeşitli alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Drosophila genlerinin yaklaşık% 60’ı insanlarda 1,2 korunur ve insan hastalık genlerinin ~% 75’i Drosophila3’te homologlara sahiptir. Genetik tarama temel olarak fonksiyon kaybı (LOF) ve fonksiyon kazancı (GOF) olmak üzere iki türe ayrılır. Drosophila’daki LOF genetik taramaları, biyolojinin neredeyse her yönünü yöneten mekanizmaların aydınlatılmasında kritik bir rol oynamıştır. Bununla birlikte, Drosophila genlerinin çoğunluğu belirgin LOF fenotiplerine4 sahip değildir ve bu nedenle, GOF taraması bu genlerin 4,5 işlevini incelemek için önemli bir yöntemdir.
İkili GAL4/UAS sistemi, Drosophila6’da dokuya özgü gen ekspresyonu için yaygın olarak kullanılır. Bu sistemde, doku, GAL4 duyarlı elemanına (UAS) bağlanan ve böylece aşağı akış genetik bileşenlerinin (örneğin, cDNA ve ORF) transkripsiyonunu aktive eden maya transkripsiyon aktivatörü GAL4’ü spesifik olarak eksprese eder6. Drosophila’da genom çapında GOF taramaları gerçekleştirmek için, genom çapında bir UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesi ve ardından Drosophila’da bir transgenik UAS-cDNA/ORF kütüphanesi oluşturmamız gerekiyor.
Halka açık cDNA/ORF klonlarından geleneksel yöntemlerle genom çapında bir UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin oluşturulması, her genin primer tasarımı ve sentezi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve jel saflaştırma, dizileme, kısıtlama sindirimi vb. dahil olmak üzere kişiselleştirilmiş tasarımlar gerektirmesi nedeniyle zaman alıcı ve zahmetlidir 7,8. Bu nedenle, böyle bir plazmit kütüphanesinin inşası, Drosophila’da genom çapında bir transgenik UAS-cDNA/ORF kütüphanesi oluşturmada hız sınırlayıcı bir adımdır. Son zamanlarda, yeni bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass)9 geliştirerek bu sorunu başarıyla çözdük. CRISPRmass’ın özü, gen düzenleme teknolojisi ve kesintisiz klonlama teknolojisinin bir kombinasyonu yoluyla bir plazmit kütüphanesinin paylaşılan vektör dizilerini manipüle etmektir.
Burada, büyük ölçüde paralel iki aşamalı test tüpü reaksiyonlarını ve ardından bakteriyel dönüşümü içeren CRISPRmass için bir protokol sunuyoruz. CRISPRmass, prensip olarak çeşitli plazmit kütüphanelerinin yüksek verimli inşası için kullanılabilen basit, hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir yöntemdir.
CRISPRmass stratejisi
CRISPRmass prosedürü, Escherichia coli (E. coli) dönüşümünden önce paralel iki aşamalı test tüpü reaksiyonları ile başlar (Şekil 1). Adım 1, cDNA/ORF plazmitlerinin özdeş vektör omurgalarının Cas9/sgRNA ile bölünmesidir. İdeal bir bölünme bölgesi, cDNA/ORF’nin 5′ ucuna bitişiktir. Dekolte ürünlerinin saflaştırılmasına gerek yoktur. Adım 2, vektöre özgü bir UAS modülünün, Gibson düzeneği (bundan böyle tek adımlı reaksiyon olarak anılacaktır) ile Cas9/sgRNA doğrusallaştırılmış cDNA/ORF plazmitlerine eklenmesidir ve UAS-cDNA/ORF plazmitleri ile sonuçlanır. Bir UAS modülünün 5′ ve 3′ terminal dizileri, doğrusallaştırılmış cDNA/ORF plazmitlerininkilerle örtüşerek tek adımlı reaksiyonu mümkün kılar.
Tek aşamalı reaksiyon ürünleri doğrudan E. coli dönüşümüne tabi tutulur. Teorik olarak, UAS modülünün antibiyotik direnç genine karşılık gelen seçim antibiyotiklerini içeren Luria-Bertani (LB) plakaları üzerinde yalnızca istenen UAS-cDNA / ORF kolonileri büyüyebilir. UAS modülü, bir çekirdek UAS modülü, cDNA veya ORF plazmitlerinden farklı bir antibiyotik direnç geni ve 5′ ve 3′ terminal dizilerinden oluşur. Bir çekirdek UAS modülü, 10 UAS kopyası, bir Hsp70 minimal promometre, phiC31 aracılı genomik entegrasyon için bir attB dizisi ve Drosophila7 için bir mini-beyaz dönüşüm belirteci içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPRmass’ın en kritik adımları sgRNA’ların tasarımı ve sgRNA’ların değerlendirilmesidir. Cas9 için yüksek verimli sgRNA’ların seçimi, CRISPRmass’ın başarısının anahtarıdır. E. coli’nin tek aşamalı reaksiyon montaj ürünleri ile dönüşümünden sonra antibiyotik içeren LB plakalarının çoğunda çok az koloni gözlenirse veya hiç koloni gözlenmezse, agaroz jel elektroforezi ile plazmit sindirimini kontrol edin. Plazmitler iyi sindirilmezse, Cas9 aktivitesini, sgRNA bozunmasını ve plazmit k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32071135 ve 31471010), Şanghay Pujiang Programı (14PJ1405900) ve Şanghay Doğa Bilimleri Vakfı (19ZR1446400) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
- Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
- Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).
