Assemblage modulaire basé sur CRISPR pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-cDNA/ORF

Le dépistage génétique impartial du génome entier est une approche puissante pour identifier les gènes impliqués dans un processus biologique donné et élucider son mécanisme. Par conséquent, il est largement utilisé dans divers domaines de la recherche biologique. Environ 60% des gènes de la drosophile sont conservés chez l’homme ^1,2, et ~75% des gènes de la maladie humaine ont des homologues chez la drosophile³. Le dépistage génétique est principalement divisé en deux types : la perte de fonction (LOF) et le gain de fonction (GOF). Les criblages génétiques LOF chez la drosophile ont joué un rôle essentiel dans l’élucidation des mécanismes qui régissent presque tous les aspects de la biologie. Cependant, la majorité des gènes de la drosophile n’ont pas de phénotypes LOF⁴ évidents, et par conséquent, le dépistage GOF est une méthode importante pour étudier la fonction de ces gènes ^4,5.

Le système binaire GAL4/UAS est couramment utilisé pour l’expression génique spécifique des tissus chez la drosophile⁶. Dans ce système, le tissu exprime spécifiquement l’activateur de transcription de la levure GAL4 qui se lie à l’élément sensible à GAL4 (UAS) et active ainsi la transcription des composants génétiques en aval (par exemple, l’ADNc et l’ORF)⁶. Pour effectuer des criblages GOF à l’échelle du génome chez la drosophile, nous devons construire une banque de plasmides UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome et, par la suite, une banque transgénique UAS-ADNc/ORF chez la drosophile.

La construction d’une banque de plasmides UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome par des méthodes conventionnelles à partir de clones d’ADNc/ORF accessibles au public prend du temps et est laborieuse, car chaque gène nécessite des conceptions individualisées, y compris la conception et la synthèse d’amorces, la réaction en chaîne par polymérase (PCR), la purification du gel, le séquençage, la digestion par restriction^{, etc. 7,8}. Par conséquent, la construction d’une telle banque de plasmides est une étape limitant le débit dans la création d’une banque transgénique UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome chez la drosophile. Récemment, nous avons réussi à résoudre ce problème en développant une nouvelle méthode, l’assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass)⁹. L’essentiel de CRISPRmass consiste à manipuler les séquences de vecteurs partagés d’une bibliothèque de plasmides grâce à une combinaison de technologie d’édition de gènes et de technologie de clonage sans couture.

Ici, nous présentons un protocole pour CRISPRmass, qui comprend des réactions massivement parallèles en tube à essai en deux étapes suivies d’une transformation bactérienne. CRISPRmass est une méthode simple, rapide, efficace et rentable qui, en principe, peut être utilisée pour la construction à haut débit de diverses banques de plasmides.

Stratégie CRISPRmass
La procédure de CRISPRmass commence par des réactions parallèles en tube à essai en deux étapes avant la transformation d’Escherichia coli (E. coli) (Figure 1). L’étape 1 est le clivage des squelettes vectoriels identiques des plasmides ADNc/ORF par Cas9/sgRNA. Un site de clivage idéal est adjacent à l’extrémité 5′ de l’ADNc/ORF. Les produits de décolleté n’ont pas besoin d’être purifiés. L’étape 2 consiste à insérer un module UAS spécifique du vecteur dans les plasmides ADNc/ORF linéarisés Cas9/sgRNA par assemblage de Gibson (ci-après appelé réaction en une seule étape), ce qui permet d’obtenir des plasmides UAS-ADNc/ORF. Les séquences terminales 5′ et 3′ d’un module UAS se chevauchent avec celles des plasmides linéarisés ADNc/ORF, permettant la réaction en une seule étape.

Les produits de réaction en une seule étape sont directement soumis à la transformation d’E. coli . Théoriquement, seules les colonies UAS-ADNc/ORF souhaitées peuvent se développer sur des plaques Luria-Bertani (LB) qui contiennent des antibiotiques sélectionnés correspondant au gène de résistance aux antibiotiques du module UAS. Le module UAS est composé d’un module UAS central, d’un gène de résistance aux antibiotiques distinct de celui des plasmides d’ADNc ou d’ORF, et des séquences terminales 5′ et 3′. Un module UAS de base comprend 10 copies d’UAS, un promoteur minimal Hsp70, une séquence attB pour l’intégration génomique médiée par phiC31 et un marqueur de transformation mini-blanc pour la drosophile⁷.