Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi
Summary
Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.
Abstract
Adaptif bağışıklık tepkisi, bir T hücresinin patojenlere ve yabancı cisimlere yanıt olarak kan, lenf ve doku yoluyla göç etme yeteneğine bağlıdır. T hücresi göçü, kemokinler, kemokin reseptörleri ve adezyon molekülleri dahil olmak üzere çevreden ve yerel bağışıklık hücrelerinden gelen birçok sinyal girişinin koordinasyonunu gerektiren karmaşık bir süreçtir. Ayrıca, T hücresi motilitesi, aktivasyon durumunu, transkripsiyonel manzarayı, adezyon molekülü ekspresyonunu ve daha fazlasını değiştirebilen dinamik çevreleyen çevresel ipuçlarından etkilenir. İn vivo, görünüşte iç içe geçmiş bu faktörlerin karmaşıklığı, T hücresi göçüne katkıda bulunan bireysel sinyalleri ayırt etmeyi zorlaştırır. Bu protokol, son derece spesifik çevresel koşullar altında T hücresi göçünü gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için T hücresi izolasyonundan bilgisayar destekli analize kadar bir dizi yöntem sağlar. Bu koşullar, göçü düzenleyen mekanizmaları aydınlatmaya, T hücresi kinetiği anlayışımızı geliştirmeye ve hayvan deneyleri yoluyla elde edilmesi zor olan güçlü mekanik kanıtlar sağlamaya yardımcı olabilir. Hücre göçünü etkileyen moleküler etkileşimlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, gelişmiş terapötikler geliştirmek için önemlidir.
Introduction
T hücreleri, adaptif, antijene özgü immün yanıtın ana efektörleridir. Popülasyon düzeyinde, T hücreleri heterojendir ve farklı özel işlevlere sahip hücresel alt kümelerden oluşur. Daha da önemlisi, CD8 + T hücreleri, enfekte olmuş veya işlevsiz hücreleri doğrudan ortadan kaldıran bağışıklık sisteminin ana sitolitik efektörleridir1.
Olgun CD8 + T hücreleri dokuda bulunur ve antijen aramak için kan ve lenfatiklerde dolaşır. Enfeksiyon sırasında, T hücreleri kan veya dokuda antijenlerle sunulur ve üretken bir bağışıklık tepkisi başlatmak için hızla dalağa veya en yakın drenaj lenf noduna boşalır. Her iki durumda da, T hücreleri aktive olur, klonal genişlemeye uğrar ve lenfatik sistemi zaten orada değilse, kana girmek için terk eder. Bu işlem sırasında, hücre içi sinyalleme, lenfatik hedef arama reseptörlerinin aşağı regülasyonunu ve dokuya özgü göç için gerekli olan çok sayıda integrin ve kemokin reseptörünün yukarı regülasyonunu sağlar2. Sonuç olarak, T hücrelerinin enfeksiyon bölgelerine yönlendirilmiş göçü, integrin ve kemokin sinyalini içeren yakınsak çevresel sinyaller tarafından yönlendirilir.
Kemokinler genel olarak iki ana sınıfa ayrılabilir: (1) farklılaşma, sağkalım ve bazal fonksiyon için gerekli olan homeostatik sinyaller ve (2) kemotaksis için gerekli olan CXCL9, CXCL10 ve CCL3 gibi inflamatuar sinyaller. Genel olarak, kemokinler, integrin ekspresyonu1’i aktive etmenin yanı sıra, kemotaksis olarak bilinen yönlü göçü yönlendiren bir sinyal gradyanı oluşturur. Kemotaksis, onları belirli bir yöne veya konuma yönlendirebilecek gradyandaki küçük değişikliklere yanıt verebilen T hücreleri ile hassas bir şekilde düzenlenir ve oldukça hassastır.
Bu T hücresi ile ilgili faktörlere ek olarak, migrasyon ayrıca hücre dışı matris (ECM) bileşimi ve yoğunluğundan da etkilenir. ECM, T hücreleri üzerindeki yapışkan integrin reseptörleri için iskele sağlayan kollajen ve proteoglikanlar dahil olmak üzere yoğun bir protein ağından oluşur. İntegrinler, her biri son derece uzmanlaşmış bağlanma alanlarına ve aşağı akış sinyalleme etkilerine sahip çeşitli bir transmembran protein ailesidir. Bir T hücresinin yüzeyindeki integrin reseptörlerinin dinamik ekspresyonu, değişen ortamlarına hızlı adaptasyon sağlar3. Daha da önemlisi, integrinler, T hücresi hareketi için gerekli itme kuvvetini üretmek için birlikte çalışan ECM ve hücre içi hücre içi iskelet aktin ağlarını birbirine bağlar.
Özetle, göç modelleri bağışıklık hücresi fenotipine veya çevresel sinyallere göre değişir. Bu karmaşık biyolojik süreçler, T hücresinin, çevreleyen hücrelerin ve lokal, enfekte olmuş dokunun yüzeyindeki sitokinlerin, kemokinlerin ve integrinlerin ekspresyonu ile sıkı bir şekilde düzenlenir. İn vivo, bu göç mekanizmaları karmaşık olabilir ve birkaç katkı sinyalindenkaynaklanabilir 4. Bu karmaşıklık nedeniyle, görünüşte birbirine kenetlenmiş değişkenler arasında nedensel bir ilişki kurmak imkansız olabilir. Bunun üstesinden gelmek için, spesifik kemokin sinyallerine yanıt ve T hücresi integrinleri ile ECM bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşim gibi T hücresi göçünün belirli yönlerini incelemek için birkaç in vitro yaklaşım vardır. Bu protokol, iki boyutlu uzayda in vitro migrasyon testleri ve belirtilen T hücresi migrasyonunu analiz etmek için hesaplamalı analiz araçları ile murin CD8+ T hücrelerini izole etme ve aktive etme yöntemlerini ele alır. Bu yöntemler, literatürde açıklanan diğer bazı hücre göçü tahlillerinde olduğu gibi karmaşık malzemeler veya cihazlar gerektirmedikleri için kullanıcı için avantajlıdır. Bu yöntemlerle oluşturulan hücre göçü verileri, in vivo olarak daha fazla ve bilinçli araştırmayı mümkün kılan basit bir şekilde bağışıklık tepkilerinin kanıtını sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İn vivo olarak yakınsak sinyallerin biyolojik etkisini anlamak zordur ve yorumlanması kolay değildir. Burada sunulan protokoller, yüksek düzeyde tanımlanmış ve biyolojik olarak ilgili koşullarda T hücresi göçünü anlamak için makul bir yöntem sağlar. Bu koşullar, araştırmacının takdirine bağlı olarak belirlenebilir ve protokoller, çeşitli T hücresi popülasyonlarının, aktivasyon durumunun ve hücre fenotipinin ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, birçok ligan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Zaman içinde bu protokollerin geliştirilmesine katkıda bulunan Kim Lab’ın önceki ve mevcut üyelerine teşekkür ederiz. Temsili veriler P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Amerika Birleşik Devletleri ve P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Amerika Birleşik Devletleri tarafından mümkün kılınmıştır. Bu yayın, kısmen Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü’nden GM135134 T32 Hibe Numarası ile mümkün olmuştur.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
References
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).
- Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850 (2023).
- Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352 (2015).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
- Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
- Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231 (2021).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
- Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
- Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
- Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
- Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
- Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963 (2014).
- Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).
