Анализ миграции in vitro в режиме реального времени на первичные мышиные CD8+ Т-клетки
Summary
Этот протокол обеспечивает метод первичной изоляции Т-клеток мыши и покадровую микроскопию миграции Т-клеток в конкретных условиях окружающей среды с количественным анализом.
Abstract
Адаптивный иммунный ответ зависит от способности Т-клеток мигрировать через кровь, лимфу и ткани в ответ на патогены и инородные тела. Миграция Т-клеток является сложным процессом, требующим координации многих сигналов, поступающих из окружающей среды и местных иммунных клеток, включая хемокины, хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии. Кроме того, на подвижность Т-клеток влияют динамические сигналы окружающей среды, которые могут изменить состояние активации, транскрипционный ландшафт, экспрессию молекул адгезии и многое другое. В естественных условиях сложность этих, казалось бы, взаимосвязанных факторов затрудняет различение отдельных сигналов, способствующих миграции Т-клеток. Этот протокол предоставляет ряд методов от выделения Т-клеток до компьютерного анализа для оценки миграции Т-клеток в режиме реального времени в высокоспецифических условиях окружающей среды. Эти условия могут помочь пролить свет на механизмы, регулирующие миграцию, улучшить наше понимание кинетики Т-клеток и предоставить убедительные механистические доказательства, которые трудно получить с помощью экспериментов на животных. Более глубокое понимание молекулярных взаимодействий, влияющих на миграцию клеток, важно для разработки улучшенных методов лечения.
Introduction
Т-клетки являются основными эффекторами адаптивного, антиген-специфического иммунного ответа. На популяционном уровне Т-клетки неоднородны, состоят из клеточных субпопуляций с различными специализированными функциями. Важно отметить, что CD8+ Т-клетки являются основными цитолитическими эффекторами иммунной системы, которые непосредственно устраняют инфицированные или дисфункциональные клетки1.
Зрелые CD8+ Т-клетки находятся в тканях и циркулируют через кровь и лимфатические системы в поисках антигенов. Во время инфекции Т-клетки получают антигены в крови или тканях и быстро дренируются к селезенке или ближайшему дренажному лимфатическому узлу, чтобы начать продуктивный иммунный ответ. В любом случае Т-клетки активируются, подвергаются клональной экспансии и покидают лимфатическую систему, чтобы попасть в кровь, если ее там еще нет. Во время этого процесса внутриклеточная сигнализация обеспечивает подавление лимфатических рецепторов самонаведения и активацию многочисленных рецепторов интегрина и хемокинов, необходимых для тканеспецифической миграции2. В конечном счете, направленная миграция Т-клеток к местам инфекции обусловлена сходящимися сигналами окружающей среды, которые включают передачу сигналов интегрина и хемокина.
Хемокины можно разделить на два основных класса: (1) гомеостатические сигналы, которые необходимы для дифференцировки, выживания и базальной функции, и (2) воспалительные сигналы, такие как CXCL9, CXCL10 и CCL3, которые необходимы для хемотаксиса. Как правило, хемокины создают градиент сигнала, который управляет направленной миграцией, известной как хемотаксис, в дополнение к активации экспрессии интегрина1. Хемотаксис тонко регулируется и обладает высокой чувствительностью, при этом Т-клетки способны реагировать на крошечные изменения градиента, которые могут привести их к определенному направлению или месту.
В дополнение к этим факторам, связанным с Т-клетками, на миграцию также влияют состав и плотность внеклеточного матрикса (ВКМ). ВКМ состоит из плотной сети белков, включая коллаген и протеогликаны, которые обеспечивают каркас для адгезивных рецепторов интегрина на Т-клетках. Интегрины представляют собой разнообразное семейство трансмембранных белков, каждый из которых обладает узкоспециализированными связывающими доменами и нисходящими сигнальными эффектами. Динамическая экспрессия интегриновых рецепторов на поверхности Т-клетки позволяет быстро адаптироваться к изменяющейся среде3. Важно отметить, что интегрины соединяют ВКМ и внутриклеточные цитоскелетные актиновые сети, которые работают вместе, чтобы генерировать движущую силу, необходимую для движения Т-клеток.
Таким образом, модели миграции варьируются в зависимости от фенотипа иммунных клеток или сигналов окружающей среды. Эти сложные биологические процессы жестко регулируются экспрессией цитокинов, хемокинов и интегринов на поверхности Т-клетки, окружающих клетках и местных, инфицированных тканях. In vivo эти миграционные механизмы могут быть сложными и могут быть результатом нескольких аддитивных сигналов4. Из-за этой сложности может оказаться невозможным установить причинно-следственную связь между, казалось бы, взаимосвязанными переменными. Чтобы преодолеть это, существует несколько подходов in vitro для изучения специфических аспектов миграции Т-клеток, таких как реакция на специфические хемокиновые сигналы и взаимодействие между интегринами Т-клеток и электронно-связывающими белками. Этот протокол рассматривает методы выделения и активации CD8+ Т-клеток мыши, с анализами миграции in vitro в двумерном пространстве и инструментами вычислительного анализа для анализа определенной миграции Т-клеток. Эти методы выгодны для пользователя, поскольку они не требуют сложных материалов или устройств, как в случае с некоторыми другими анализами миграции клеток, описанными в литературе. Данные о миграции клеток, полученные с помощью этих методов, могут предоставить доказательства иммунных реакций в упрощенной форме, что позволяет проводить дальнейшие обоснованные исследования in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Понимание биологического воздействия сходящихся сигналов in vivo является сложной и непростой задачей. Представленные здесь протоколы представляют собой разумный метод для понимания миграции Т-клеток в строго определенных и биологически значимых условиях. Эти условия могут быть о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим бывших и нынешних членов Лаборатории Кима, которые внесли свой вклад в разработку этих протоколов на протяжении долгого времени. Репрезентативные данные были получены с помощью P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Соединенные Штаты и P01 HL018208/HLBI NIH HHS/Соединенные Штаты. Эта публикация стала возможной отчасти благодаря гранту No T32 GM135134 от Институциональной премии Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
References
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).
- Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850 (2023).
- Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352 (2015).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
- Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
- Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231 (2021).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
- Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
- Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
- Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
- Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
- Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963 (2014).
- Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).
