Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen
Summary
Dieses Protokoll bietet eine Methode zur primären Isolierung von murinen T-Zellen und eine Zeitraffermikroskopie der T-Zellmigration unter spezifischen Umweltbedingungen mit quantitativer Analyse.
Abstract
Die adaptive Immunantwort beruht auf der Fähigkeit einer T-Zelle, als Reaktion auf Krankheitserreger und Fremdkörper durch Blut, Lymphe und Gewebe zu wandern. Die T-Zell-Migration ist ein komplexer Prozess, der die Koordination vieler Signaleingänge aus der Umwelt und lokalen Immunzellen erfordert, einschließlich Chemokinen, Chemokinrezeptoren und Adhäsionsmolekülen. Darüber hinaus wird die Motilität von T-Zellen durch dynamische Umgebungsreize beeinflusst, die den Aktivierungszustand, die Transkriptionslandschaft, die Expression von Adhäsionsmolekülen und vieles mehr verändern können. In vivo macht es die Komplexität dieser scheinbar miteinander verflochtenen Faktoren schwierig, einzelne Signale zu unterscheiden, die zur T-Zell-Migration beitragen. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Methoden, von der T-Zellisolierung bis hin zur computergestützten Analyse, um die T-Zellmigration in Echtzeit unter hochspezifischen Umweltbedingungen zu bewerten. Diese Bedingungen können dazu beitragen, Mechanismen aufzuklären, die die Migration regulieren, unser Verständnis der T-Zell-Kinetik zu verbessern und starke mechanistische Beweise zu liefern, die durch Tierversuche nur schwer zu erlangen sind. Ein tieferes Verständnis der molekularen Wechselwirkungen, die sich auf die Zellmigration auswirken, ist wichtig, um verbesserte Therapeutika zu entwickeln.
Introduction
T-Zellen sind die Haupteffektoren der adaptiven, antigenspezifischen Immunantwort. Auf Populationsebene sind T-Zellen heterogen und bestehen aus zellulären Untergruppen mit unterschiedlichen spezialisierten Funktionen. Wichtig ist, dass CD8+ T-Zellen die wichtigsten zytolytischen Effektoren des Immunsystems sind, die infizierte oder dysfunktionale Zellen direkt eliminieren1.
Reife CD8+ T-Zellen befinden sich im Gewebe und zirkulieren auf der Suche nach Antigenen durch Blut und Lymphgefäße. Während der Infektion werden T-Zellen mit Antigenen im Blut oder Gewebe präsentiert und fließen schnell in die Milz oder den nächstgelegenen drainierenden Lymphknoten ab, um eine produktive Immunantwort zu starten. In beiden Fällen werden T-Zellen aktiviert, durchlaufen eine klonale Expansion und verlassen das Lymphsystem, um ins Blut zu gelangen, falls dies nicht bereits der Fall ist. Während dieses Prozesses bewirkt die intrazelluläre Signalübertragung die Herunterregulierung der lymphatischen Homing-Rezeptoren und die Hochregulierung zahlreicher Integrin- und Chemokinrezeptoren, die für die gewebespezifische Migration unerlässlich sind2. Letztendlich wird die gerichtete Migration von T-Zellen zu den Infektionsherden durch konvergierende Umweltsignale angetrieben, zu denen auch Integrin- und Chemokin-Signale gehören.
Chemokine können grob in zwei Hauptklassen eingeteilt werden: (1) homöostatische Signale, die für die Differenzierung, das Überleben und die Basalfunktion essentiell sind, und (2) Entzündungssignale wie CXCL9, CXCL10 und CCL3, die für die Chemotaxis benötigt werden. Im Allgemeinen erzeugen Chemokine einen Signalgradienten, der die gerichtete Migration, die sogenannte Chemotaxis, antreibt und zusätzlich die Integrin-Expression1 aktiviert. Die Chemotaxis ist fein reguliert und hochempfindlich, wobei T-Zellen in der Lage sind, auf winzige Änderungen des Gradienten zu reagieren, die sie in eine bestimmte Richtung oder einen bestimmten Ort führen können.
Zusätzlich zu diesen T-Zell-bezogenen Faktoren wird die Migration auch von der Zusammensetzung und Dichte der extrazellulären Matrix (EZM) beeinflusst. Die EZM besteht aus einem dichten Netzwerk von Proteinen, darunter Kollagen und Proteoglykane, die das Gerüst für adhäsive Integrinrezeptoren auf T-Zellen bilden. Integrine sind eine vielfältige Familie von Transmembranproteinen, jedes mit hochspezialisierten Bindungsdomänen und nachgeschalteten Signaleffekten. Die dynamische Expression von Integrinrezeptoren auf der Oberfläche einer T-Zelle ermöglicht eine schnelle Anpassung an ihre sich verändernde Umgebung3. Wichtig ist, dass Integrine die EZM und intrazelluläre Zytoskelett-Aktinnetzwerke verbinden, die zusammenarbeiten, um die für die T-Zellbewegung erforderliche Antriebskraft zu erzeugen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Migrationsmuster je nach Phänotyp der Immunzellen oder Umweltsignalen variieren. Diese komplexen biologischen Prozesse werden durch die Expression von Zytokinen, Chemokinen und Integrinen auf der Oberfläche der T-Zelle, den umgebenden Zellen und dem lokalen, infizierten Gewebe streng reguliert. In vivo können diese Migrationsmechanismen komplex sein und sich aus mehreren additiven Signalen ergeben4. Aufgrund dieser Komplexität kann es unmöglich sein, einen kausalen Zusammenhang zwischen scheinbar ineinandergreifenden Variablen herzustellen. Um dies zu überwinden, gibt es mehrere In-vitro-Ansätze , um spezifische Aspekte der T-Zell-Migration zu untersuchen, wie z. B. die Reaktion auf spezifische Chemokinsignale und die Interaktion zwischen T-Zell-Integrinen und EZM-bindenden Proteinen. Dieses Protokoll befasst sich mit Methoden zur Isolierung und Aktivierung von murinen CD8+ T-Zellen mit In-vitro-Migrationsassays im zweidimensionalen Raum und computergestützten Analysewerkzeugen zur Analyse der spezifischen T-Zellmigration. Diese Verfahren sind für den Benutzer vorteilhaft, da sie keine ausgeklügelten Materialien oder Vorrichtungen erfordern, wie bei einigen anderen Zellmigrationsassays, die in der Literatur beschrieben sind. Die mit diesen Methoden erzeugten Zellmigrationsdaten können auf vereinfachte Weise Hinweise auf Immunantworten liefern, die eine weitere, fundierte Untersuchung in vivo ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Verständnis der biologischen Auswirkungen konvergierender Signale in vivo ist eine Herausforderung und nicht einfach zu interpretieren. Die hierin vorgestellten Protokolle stellen eine vernünftige Methode dar, um die T-Zell-Migration unter hochdefinierten und biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen. Diese Bedingungen können nach Ermessen des Prüfarztes festgelegt werden, und die Protokolle können an die Bedürfnisse verschiedener T-Zellpopulationen, des Aktivierungsstatus und des Zellphänotyps a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken früheren und aktuellen Mitgliedern des Kim-Labors, die im Laufe der Zeit zur Entwicklung dieser Protokolle beigetragen haben. Repräsentative Daten wurden durch P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Vereinigte Staaten und P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Vereinigte Staaten ermöglicht. Diese Veröffentlichung wurde zum Teil durch die Fördernummer T32 ermöglicht, die GM135134 des Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award vergeben wurde.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
References
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).
- Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850 (2023).
- Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352 (2015).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
- Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
- Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231 (2021).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
- Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
- Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
- Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
- Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
- Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963 (2014).
- Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).
