Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento primario delle cellule T murine e la microscopia time-lapse della migrazione delle cellule T in specifiche condizioni ambientali con analisi quantitativa.
La risposta immunitaria adattativa dipende dalla capacità di una cellula T di migrare attraverso il sangue, la linfa e i tessuti in risposta a agenti patogeni e corpi estranei. La migrazione delle cellule T è un processo complesso che richiede il coordinamento di molti input di segnale provenienti dall’ambiente e dalle cellule immunitarie locali, tra cui chemochine, recettori per chemochine e molecole di adesione. Inoltre, la motilità delle cellule T è influenzata da segnali ambientali dinamici circostanti, che possono alterare lo stato di attivazione, il paesaggio trascrizionale, l’espressione delle molecole di adesione e altro ancora. In vivo, la complessità di questi fattori apparentemente intrecciati rende difficile distinguere i singoli segnali che contribuiscono alla migrazione delle cellule T. Questo protocollo fornisce una serie di metodi, dall’isolamento delle cellule T all’analisi assistita da computer, per valutare la migrazione delle cellule T in tempo reale in condizioni ambientali altamente specifiche. Queste condizioni possono aiutare a chiarire i meccanismi che regolano la migrazione, migliorando la nostra comprensione della cinetica delle cellule T e fornendo forti prove meccanicistiche difficili da ottenere attraverso esperimenti sugli animali. Una comprensione più profonda delle interazioni molecolari che influenzano la migrazione cellulare è importante per sviluppare terapie migliorate.
Le cellule T sono i principali effettori della risposta immunitaria adattativa antigene-specifica. A livello di popolazione, le cellule T sono eterogenee, composte da sottogruppi cellulari con funzioni specializzate distinte. È importante sottolineare che le cellule T CD8+ sono i principali effettori citolitici del sistema immunitario, che eliminano direttamente le cellule infette o disfunzionali1.
Le cellule T CD8+ mature risiedono nei tessuti e circolano nel sangue e nei linfatici alla ricerca di antigeni. Durante l’infezione, le cellule T vengono presentate con antigeni nel sangue o nei tessuti e drenano rapidamente nella milza o nel linfonodo drenante più vicino per iniziare una risposta immunitaria produttiva. In entrambi i casi, le cellule T si attivano, subiscono un’espansione clonale e lasciano il sistema linfatico per entrare nel sangue, se non già presente. Durante questo processo, la segnalazione intracellulare conferisce la sottoregolazione dei recettori di homing linfatico e la sovraregolazione di numerosi recettori delle integrine e delle chemochine essenziali per la migrazione tessuto-specifica2. In definitiva, la migrazione diretta delle cellule T verso i siti di infezione è guidata da segnali ambientali convergenti che includono la segnalazione di integrine e chemochine.
Le chemochine possono essere classificate in due classi principali: (1) segnali omeostatici, che sono essenziali per la differenziazione, la sopravvivenza e la funzione basale, e (2) segnali infiammatori, come CXCL9, CXCL10 e CCL3, che sono necessari per la chemiotassi. Generalmente, le chemochine creano un gradiente di segnale che guida la migrazione direzionale, nota come chemiotassi, oltre ad attivare l’espressione dell’integrina1. La chemiotassi è finemente regolata e altamente sensibile, con le cellule T in grado di rispondere a piccoli cambiamenti di gradiente che possono portarle verso una direzione o una posizione specifica.
Oltre a questi fattori correlati alle cellule T, la migrazione è influenzata anche dalla composizione e dalla densità della matrice extracellulare (ECM). La ECM è costituita da una fitta rete di proteine, tra cui collagene e proteoglicani, che forniscono l’impalcatura per i recettori delle integrine adesive sulle cellule T. Le integrine sono una famiglia diversificata di proteine transmembrana, ciascuna con domini di legame altamente specializzati ed effetti di segnalazione a valle. L’espressione dinamica dei recettori delle integrine sulla superficie di una cellula T consente un rapido adattamento ai loro ambienti mutevoli3. È importante sottolineare che le integrine collegano la MEC e le reti di actina citoscheletrica intracellulare che lavorano insieme per generare la forza propulsiva necessaria per il movimento delle cellule T.
In sintesi, i modelli di migrazione variano in base al fenotipo delle cellule immunitarie o ai segnali ambientali. Questi complessi processi biologici sono strettamente regolati dall’espressione di citochine, chemochine e integrine sulla superficie della cellula T, delle cellule circostanti e del tessuto locale infetto. In vivo, questi meccanismi migratori possono essere complessi e possono derivare da diversi segnali additivi4. A causa di questa complessità, può essere impossibile stabilire una relazione causale tra variabili apparentemente interconnesse. Per ovviare a ciò, esistono diversi approcci in vitro per studiare aspetti specifici della migrazione delle cellule T, come la risposta a specifici segnali di chemochine e l’interazione tra le integrine delle cellule T e le proteine leganti la ECM. Questo protocollo affronta metodi per isolare e attivare le cellule T CD8+ murine, con saggi di migrazione in vitro nello spazio bidimensionale e strumenti di analisi computazionale per l’analisi della migrazione delle cellule T specificate. Questi metodi sono vantaggiosi per l’utente perché non richiedono materiali o dispositivi sofisticati, come con alcuni altri saggi di migrazione cellulare descritti in letteratura. I dati sulla migrazione cellulare generati con questi metodi possono fornire prove di risposte immunitarie in modo semplicistico che consente ulteriori indagini informate in vivo.
Comprendere l’impatto biologico dei segnali convergenti in vivo è impegnativo e non facile da interpretare. I protocolli qui presentati forniscono un metodo ragionevole per comprendere la migrazione delle cellule T in condizioni altamente definite e biologicamente rilevanti. Queste condizioni possono essere specificate a discrezione dello sperimentatore e i protocolli possono essere modificati per adattarsi alle esigenze delle varie popolazioni di cellule T, allo stato di attivazione e al fenotipo cellulare. In…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i membri precedenti e attuali del Kim Lab che hanno contribuito allo sviluppo di questi protocolli nel tempo. Dati rappresentativi sono stati resi possibili da P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Stati Uniti e P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Stati Uniti. Questa pubblicazione è stata resa possibile in parte dalla sovvenzione numero T32 GM135134 dall’Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award.
10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
NIS elements | Nikon | Software | |
non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
Volocity | PerkinElmer | Software |