Microfluïdische benadering om gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie van individuele polyfunctionele cellen op te lossen

Alle experimenten werden uitgevoerd onder ethische overeenkomst EK202-N-56 en goedgekeurd door de ethische commissie van ETH Zürich. De behandeling van menselijke cellen werd uitgevoerd in een laminaire flowkast in een laboratorium met bioveiligheidsniveau 2. OPMERKING: In de volgende secties wordt het protocol beschreven voor het meten van tijdopgeloste cytokinesecretie op het niveau van één cel. De hier beschreven procedure wordt toegepast op de stimulatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) met lipopolysaccharide (LPS) en de parallelle meting van de cytokines IL-6, TNFα en IL-1β. Indien nodig kan het protocol echter worden aangepast aan andere celtypen, stimulerende middelen en cytokines. 1. De vervaardiging van de observatiekamer OPMERKING: Om beweging van de druppels tijdens de beeldvorming te voorkomen, is een observatiekamer voorbereid met een hoogte die ongeveer 10% kleiner is dan de druppeldiameter. Voorbereiding van de snijdubbelzijdige tape en de bovenste glasplaatTeken of laad het gewenste ontwerp van de kameruitsparing in het tabblad Ontwerp van de snijsoftware. Voor de specifieke afmetingen die hier worden gebruikt, zie figuur 2E. Bevestig het dubbelzijdige plakband van 32 μm dikte met tape op de zelfklevende snijmat en plaats de snijmat in de automatische snijmachine. Knip het kamerontwerp uit de tape, terwijl u erop let dat de lange zijden van de kamer in dezelfde richting worden gesneden om het gemakkelijker los te maken in stap 1.3. Bewaar de tape-uitsparingen bij kamertemperatuur voor langdurige opslag. Bewaar ze voor kortstondige opslag bij -20 °C en verwijder ze pas kort voor stap 1.3. voor een eenvoudigere bediening. Boor twee gaten met een diameter van ongeveer 1 mm in het midden van een standaard microscoopglaasje (76 mm x 26 mm x 1 mm), met een afstand tussen de twee gaten van ongeveer 3,5 cm. Reiniging en plasma-activering van objectglaasjesReinig een glasplaatje met gaatjes en een zonder gaatjes met zeep. Spoel goed af met gedestilleerd water en droog af met pluisvrije precisiedoekjes. Plaats de objectglaasjes in een plasmareiniger en plasmabehandel de bovenste oppervlakken gedurende 10 minuten op 55 W. Verwijder de glasplaatjes en ga verder met stap 1.3. Samenstelling van de kamerPlaats het objectglaasje met gaten op een schoon oppervlak met de plasma-geactiveerde kant naar boven, zonder het geactiveerde oppervlak aan te raken. Verwijder de beschermlaag van één kant van het dubbelzijdige plakband, in dezelfde snijrichting. Lijn de tape-uitsparing uit met de randen van het objectglaasje en de geboorde gaten zonder aan te raken en breng de tape langzaam in contact met het glasplaatje, beginnend bij de korte zijde.OPMERKING: Let erop dat er geen rekken of vouwen in de tape ontstaan, omdat dit zal resulteren in onjuiste kamerhoogtes. Aangezien deze stap foutgevoelig is en enige praktijkervaring vereist, is het raadzaam om meerdere glasplaatjes parallel te maken. Verwijder de tweede beschermlaag van de tape, opnieuw in de snijrichting, en plaats het tweede glasplaatje zonder gaten met het geactiveerde oppervlak naar beneden gericht. Druk het hele oppervlak van de twee glasplaatjes tegen elkaar door er een plat bord op te leggen en met kracht van het bovenlichaam ongeveer 10 s naar beneden te drukken. Nadat u de twee glasplaatjes in elkaar hebt gezet, draait u de kamer om zodat de twee gaten naar u toe wijzen. Lijm de nanopoorten op de twee gaten door een kleine hoeveelheid UV-uithardende lijm in de ring onder de poort te doen en de poort bovenop het gat in het glasplaatje te plaatsen. Voeg een ring van UV-uithardende lijm toe rond de poort en hard de lijm uit met een UV-lamp. De kamer zou er nu uit moeten zien zoals afgebeeld in figuur 2E. Ga direct door naar stap 1.4.OPMERKING: UV-licht kan de ogen en huid beschadigen. Draag geschikte beschermingsmiddelen. Fluorofiele coating van het kameroppervlakOPMERKING: Deze stap moet plaatsvinden binnen 1 uur na plasmabehandeling van de objectglaasjes (stap 1.2.2) om een goede coatingefficiëntie te garanderen.Bereid vers 1 ml 1% fluorosilaanoplossing (1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichloorsilaan) in gefluoreerde olie (HFE-7500) en vul deze in een spuit. Duw de coatingoplossing door een PTFE-spuitfilter en een naald van 27G x 0.75 inch die is aangesloten op een PTFE-microslang van 0.3 mm x 0.76 mm in de observatiekamer. Spoel na 1 minuut incubatie de coatingoplossing uit de kamer met behulp van stikstofdruk onder een zuurkast. Spoel de kamer met gefluoreerde olie (alleen HFE-7500) met behulp van een andere spuit. Bewaar de kamer gevuld met gefluoreerde olie met gesloten inlaten bij kamertemperatuur (RT). Spoel na elk experiment de cellen en druppels direct uit om een goed behoud van de coating te garanderen.OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de kamers kunnen enkele maanden worden opgeslagen en hergebruikt. Kamerhouder met magnetenVoor de uitlijning van de magnetische nanodeeltjes brengt u een statisch magnetisch veld aan op de observatiekamer tijdens het inkapselen en de beeldvorming van druppels. Plaats hiervoor de kamer in een op maat gemaakte 3D-geprinte microscopiehouder (zie figuur 2D en het bestand in Bounab et al.17 Aanvullende gegevens 4) die twee neodymiummagneten langs de lange zijden van de kamer houdt. 2. Functionalisering van nanodeeltjes OPMERKING: Het proces voor de functionalisering van nanodeeltjes is vergelijkbaar voor elk cytokine, het enige verschil is de toevoeging van cytokine-specifieke vangstantilichamen. De functionalisatie voor elk cytokine wordt parallel uitgevoerd in verschillende, individuele reactiebuisjes. Voorafgaand aan dit protocol werden het TNFα-vangstantilichaam en het IL-1β-detectieantilichaam intern gelabeld met respectievelijk biotine en Alexa Fluor 647. De conjugatie werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant op de website van de verkoper (zie links in de materiaaltabel) en de antilichamen werden gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 °C. Voeg 50 μL streptavidine-gefunctionaliseerde nanodeeltjes (diameter (Ø) 300 nm) toe aan de buis die bestemd is voor TNFα-detectie, 50 μL voor IL-1β en 100 μL voor IL-6. Verdun de nanodeeltjesoplossing 1:1 (v/v) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg aan elk buisje 1/20 (v/v) van het respectieve volume van de gebiotinyleerde vangantilichamen toe (voorraadconcentraties bij 0,5 mg/ml) en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.OPMERKING: Wanneer u kleine hoeveelheden aan de nanodeeltjesoplossing toevoegt, deponeert u het volume aan de bovenkant van de buis en spoelt u het meerdere keren weg met het grootste deel van de oplossing. Dit zorgt voor een goede menging en voorkomt de vorming van aggregaten. Voeg 1/100 (v/v) 1 mM D-biotineoplossing toe aan de buis en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Dit resulteert in een uiteindelijke biotineconcentratie van 10 μM.OPMERKING: Overtollig biotine blokkeert vrije bindingszijden op de nanodeeltjes en vermindert ongewenste aggregaatvorming. Verzamel de deeltjes door een neodymium magneet dicht bij de buis te houden. Wacht tot het supernatans helder is en gooi het supernatant weg.OPMERKING: De magneten die tijdens de test worden gebruikt, vertonen zeer sterke aantrekkingskrachten, die fysieke schade kunnen veroorzaken als twee magneten per ongeluk in elkaar klikken. Om niet-specifieke adsorptie aan het oppervlak van nanodeeltjes te verminderen, resuspendeert u de nanodeeltjes onmiddellijk in 0,5x het uiteindelijke volume van stap 2.1 van Pluronic F-127 (10%) en 0,5x het volume PBS. Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij RT. Verzamel de deeltjes met behulp van de magneet, gooi het supernatant weg en resuspendeer in 1x het volume van de opslagbuffer (RPMI 1640, 5% knock-out serumvervanging, 1% pen/streptokokken, 1% recombinant humaan serumalbumine (HSA), 25 mM HEPES, 0,1% Pluronic F-127). Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij RT.OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de deeltjes kunnen nu maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard. Onmiddellijk voor het inkapselen, resuspendeert de deeltjes door te pipetteren en mengt de geconjugeerde nanodeeltjes in een verhouding van 2:1:1 (v/v) voor respectievelijk IL-6:TNFα:IL-1β.OPMERKING: De verschillende verhoudingen van gefunctionaliseerde nanodeeltjes zijn afhankelijk van het gebruikte antilichaampaar voor elk cytokine en zijn experimenteel bepaald door middel van kalibratiemonsters om een optimaal dynamisch bereik te verkrijgen. Wassen met volledige media (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen/Streptokokken, 25 mM HEPES) door de deeltjes met de magneet te verzamelen, het supernatans weg te gooien en opnieuw te suspenderen. Herhaal deze stap, maar resuspendeer alleen in 0,5x het volume van volledige media uit stap 2.7. Voeg de verschillend gelabelde IL-6-, TNFα- en IL-1β-detectieantilichamen toe aan de oplossing om een eindconcentratie van elk 10 nM te bereiken. De oplossing is nu klaar om gebruikt te worden voor de druppelexperimenten. 3. Voorbereiding van de cel OPMERKING: PBMC werden geïsoleerd uit een buffy coat die ze hadden ontvangen van de bloedbank van Zürich. De cellen werden ingevroren en gedurende enkele maanden bewaard in cryovials (1 x 10,7 cellen/flacon) in vloeibare stikstof. Cel ontdooienLaat 1 uur voor aanvang van het experiment de volledige media en MACS-buffer (2 mM EDTA, 0,5% BSA in DPBS, steriel gefilterd) opwarmen bij RT. Bereid de buis met de cellen voor door 9 ml volledige media toe te voegen aan een buis van 15 ml en deze in het waterbad bij 37 °C te bewaren. Haal een PBMC cryovial (met ~1 x 107 cellen) uit de opslag in vloeibare stikstof. Draai de cryotube in het waterbad bij 37 °C tot er nog maar een kleine hoeveelheid ijs overblijft. Veeg de buis af met 70% EtOH en breng deze over naar de laminaire stromingskast. Voeg 1 ml voorverwarmde complete media toe aan de cryovial, meng voorzichtig en breng alle cellen over in de buis met warme complete media. De cryovial kan worden gewassen met 1 ml warme, complete media om het maximale aantal cellen te herstellen. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g bij RT, gooi het supernatans weg en resuspendeer voorzichtig met een pipet de celpellet met 1 ml volledig medium. Voeg 9 ml volledig medium toe. Draai de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatans weg en resuspendeer zoals eerder in 1 ml volledig medium. Tel de cellen met behulp van de beschikbare cellenteller. In dit geval werd een geautomatiseerde cellenteller gebruikt. Cellen werden geteld door 10 μL celsuspensie te mengen met 10 μL Trypanblauw en 10 μL van het mengsel over te brengen naar het cellentelglaasje. Kleuring en FcR-blokkeringBereken het totale aantal cellen en het volume dat nodig is om de cellen te resuspenderen bij 2 x 106 levende cellen/ml. Bereid de celkleuringsoplossing (CellTrace Violet) voor door de bouillon (5mM) 1000x te verdunnen in PBS (werkconcentratie van 5 μM). Draai de cellen 5 minuten rond op 500 x g bij RT. Gooi het supernatans weg en breng de cellen opnieuw in suspensie in het berekende volume van de in stap 3.2.1 bereide celkleuringsoplossing. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 5 min. Blus aan het einde van de incubatie de resterende kleurstof in de oplossing af door volledige media toe te voegen (ten minste 2x het volume van de kleurstofoplossing). Draai de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de celpellet in 60 μL MACS-buffer en voeg 20 μL humaan FcR-blok toe per 1 x 107 cellen. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij RT. Vul de buis tot 10 ml met MACS Buffer en draai de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatans weg en suspendeer de cellen in 1 ml volledig medium Tel de cellen zoals beschreven in stap 3.1.6. Celstimulatie met LPSVerdun de cellen met behulp van het celgetal tot 1 x 106 cellen/ml en breng 2 ml cellen over in elk putje in een plaat met ultralage binding van 6 putjes. Verdun LPS in volledige media en voeg het toe aan het putje met de cellen voor een uiteindelijke concentratie LPS van 1 μg/ml. Incubeer de cellen gedurende 6 uur bij 37 °C. Voorbereiding voor inkapselingAan het einde van de stimulatietijd brengt u de celsuspensie over in een nieuw buisje van 15 ml. Voeg 1 ml volledig medium toe aan het lege vakje. Maak met een celschraper de resterende cellen los. Breng de cellen over in een nieuw buisje van 15 ml. Was het putje met 1 ml volledig medium en breng het over naar een andere buis van 15 ml. Draai de twee buisjes 5 minuten rond op 500 x g bij RT en breng 1 ml van de onverdunde supernatansoplossing (uit het eerste buisje met de niet-gewassen cellen) over naar een nieuw buisje voor verdere analyse indien nodig (bijv. ELISA). Gooi de rest van de supernatanten weg. Resuspendeer de pellets in 0,5 ml compleet medium, combineer de cellen uit dezelfde put en breng ze over in een centrifugebuis. Tel de cellen zoals beschreven in stap 3.1.6. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g bij RT en gooi het grootste deel van het supernatans weg (laat ongeveer 100 μl over). Zonder de pellet opnieuw te suspenderen, voegt u heel voorzichtig 200 μL volledig medium toe. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in volledige media in een concentratie van 6,6 tot 13,3 x 106 cellen/ml om een gemiddeld celaantal per druppel van λ = 0,2-0,4 voor inkapseling te bereiken, zoals gedefinieerd in stap 8.6.OPMERKING: Stappen 3.4.6 en 3.4.7 moeten onmiddellijk voor de inkapseling worden uitgevoerd om cytokinesecretie in het supernatant te voorkomen. Het aantal cellen per druppel volgt een Poisson-verdeling: , waarbij P de fractie druppeltjes aangeeft die X cellen bevatten en λ het gemiddelde aantal cellen per druppel is. 4. Inkapseling en druppelproductie OPMERKING: De inkapseling van cellen in druppeltjes wordt mogelijk gemaakt door een microfluïdische druppelgeneratorchip, waarvan de fabricage elders in zeer detail wordt beschreven17. Alternatieven zijn in de handel verkrijgbaar (zie voorbeeld in de materiaaltabel). Een geschikt chipontwerp voor druppelgeneratoren heeft twee inlaten voor waterige fasen, één inlaat voor de oliefase en één uitlaat voor de gegenereerde druppels. Bovendien moet een geschikte chip voor commerciële druppelgeneratoren de productie van water in gefluoreerde oliedruppels van 40-60 pL volume mogelijk maken. Het hier beschreven protocol resulteert in water/olie-emulsies (druppels) met een diameter van 50 μm. Het gebruik van verschillende opties voor het wijzigen van het protocol kan resulteren in grotere of kleinere druppels. Voorbereiding van de spuitpomp (Figuur 2A)Vul een spuit van 1 ml met 500 μL continue fase bestaande uit 2% 008-fluorsurfactant in HFE-7500 gefluoreerde olie. Sluit een naald van 27G x 0,75 inch aan op PTFE-microslangen van 0,30 mm x 0,76 mm en monteer het geheel op de spuit en vervolgens op de spuitpomp.OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen lucht in de spuit of canule achterblijft, omdat dit consistente stroomsnelheden voorkomt. Bereid twee op maat gemaakte pipetpuntconnectoren voor op de waterige fasen (Figuur 2B): Pons een gat met een biopsiepons van Ø0,75 mm in het midden van een ~5 mm hoge PDMS-uitsparing met Ø6 mm. Trek ~3 cm PTFE-slang (0.56 mm binnendiameter, 1.07 mm buitendiameter) door het gat in de PDMS-uitsparing en duw het geheel in de bovenkant van een pipetpunt van 200 μL. Sluit de andere kant van de buis aan op een naald van 23Gx 1.25 inch. Sluit de connector af door UV-uithardende lijm op de pipet te smeren en uit te harden met UV-licht.OPMERKING: Aangezien UV-licht schadelijk is voor het oog, moet u ter bescherming een UV-blokkerende bril dragen. Vul twee spuiten van 1 ml met 500 μl lichte minerale olie, bevestig twee naalden van 23 G met de op maat gemaakte opzetstukken en monteer beide op de spuitpomp. Aspireer 30 μl nanodeeltje en 30 μl celoplossing in de pipetpunten van de waterige fasen met behulp van de besturingssoftware van de spuitpomp. Bereid een observatiekamer voor door het oppervlak met water schoon te maken om vuil en stof te verwijderen en droog het af met precisiedoekjes. Klem de kamer in de bedrukte kamerhouder die is uitgerust met twee neodymium magneten.OPMERKING: Zorg ervoor dat de magneten in de juiste richting wijzen (elkaar aantrekken) om een langwerpig aggregaat te vormen. Kantel de kamer lichtjes (30°). Open beide poorten en steek een papieren handdoek in de bovenste poort om de overtollige buitenfase tijdens het vullen te absorberen. Druppelproductie en kamervullingSluit de continue fase via een slang aan op de bovenste inlaat van de microfluïdische chip (Figuur 2A,C,F). Spoel de chip gedurende ongeveer 30 s met continue fase met een debiet van 1800 μL/h. Sluit de pipetpunten van de waterige oplossingen aan op de twee middelste inlaten (Figuur 2A, C, F). Start de stroom van de waterige oplossing met elk 200 μL/u en laat de kanalen en de uitlaat met vloeistof vullen. Bij gebruik van magnetische nanodeeltjes moet een homogene, bruinrood gekleurde oplossing uit de chipuitlaat stromen. Zodra de vloeistof bij de uitlaat verschijnt, start u de gefluoreerde oliefasestroom op 800 μL/u en wacht u tot een stabiele druppelproductie is vastgesteld, bevestigd door de uitstroom van een homogene, grijze, glanzende oplossing bij de uitlaat. Zodra een stabiele productie van druppeltjes is vastgesteld, verzamelt u de geproduceerde druppeltjes door PTFE-microslangen (0.3 mm binnendiameter x 0.76 mm buitendiameter) aan te sluiten op de uitlaatpoort en ze naar een observatiekamer te leiden door de microslang door de hulsmodule van een handdichte fitting uit één stuk te halen (Figuur 2A). Als de juiste druppelproductie optreedt, moet een homogene, glanzende vloeistof de kamer vullen met een rechte voorkant van onder naar boven. Zodra de kamer is gevuld, stopt u de stroom en sluit u de poorten af met poortpluggen met handvaste druk.NOTITIE: Let op dat u de kamer niet te strak sluit. Insluiting of instroom van lucht kan leiden tot bewegingen van de druppels en zo de tracking tijdens de meting in gevaar brengen. Spoel de chip na de druppelproductie met gefluoreerde olie en blaas eventuele herinneringen aan vloeistof uit met stikstof om de functie te behouden. Chips kunnen meerdere keren worden hergebruikt en maandenlang worden bewaard, zolang ze niet verstopt raken. Figuur 2: Overzicht van de microfluïdische opstelling. (A) Opstelling voor druppelinkapseling met de spuitpomp, de druppelgeneratiechip en de observatiekamer en microscoophouder. (B) Afbeelding van de geperforeerde PDMS-plug (boven) om een connector te vormen naar een pipetpunt van 200 μl (onder), zoals beschreven in protocolstap 4.1.2. (C) Afbeeldingen van de aansluiting van de slangen en pipetpunten op de chip voor het genereren van druppels. (D) Foto van de kamer die in de op maat gemaakte 3D-geprinte microscoophouder is geplaatst met twee magneten aan de boven- en onderkant. (E) Foto van de observatiekamer (met witte tape ter illustratie). (F) Lay-out van de microfluïdische chip voor het maken van druppels (schaalbalk: 750 μm). Dit cijfer is gewijzigd van17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Beeldacquisitie en -meting OPMERKING: Beeldacquisitie wordt uitgevoerd op een standaard omgekeerde epifluorescentiemicroscoop die is ingesloten in een incubator, waardoor metingen bij 37 °C mogelijk zijn. De hier beschreven instellingen zijn specifiek voor een Nikon Eclipse Ti2-microscoop die draait met de NIS Elements-software (V. 5.30.04) die is uitgerust met een Orca Fusion-camera, maar zijn over het algemeen aanpasbaar aan andere fluorescentiemicroscopen en camera’s. Meetparameters instellenAls u de grootte van de afbeelding wilt instellen, selecteert u een matrixgrootte van 10 x 10 afbeeldingen. Deze array zal ongeveer 50.000-70.000 druppels bevatten. Gebruik 1% overlap en activeer overvloeien voor het samenvoegen van afbeeldingen. Om het aantal gemeten kanalen in te stellen, selecteert u het DAPI-kanaal voor celdetectie, FITC-, TRITC-, Cy5-kanalen voor cytokinedetectie (beadlines) en het BF-kanaal voor druppeldetectie. Gebruik pixelbinning 2 x 2 en 16-bits voor bitdiepte. Pas de camera-instellingen aan om pixelwaarden met druppelintensiteit te bereiken die niet voor elk fluorescentiekanaal het maximum van de camera bereiken.OPMERKING: Exacte belichtingstijden en lampintensiteiten voor elk kanaal zijn afhankelijk van het gebruikte model en de reagentia en worden vastgesteld voordat kalibratiecurven worden gegenereerd (stap 7). Het gebruik van dezelfde acquisitie-instellingen bij kalibratie en celmetingen is belangrijk voor nauwkeurige kwantificering. Om de tijdopgeloste meting in te stellen, selecteert u elke 30 minuten een meting voor in totaal 9 metingen.OPMERKING: Meetparameters kunnen verschillen voor gebruikte cellen, stimulerende middelen, reagentia, gemeten cytokines, incubatietemperatuur en microscoopmodellen. De meting startenMonteer de kamerhouder op de microscoop met een tafel in putplaatformaat (Figuur 2D) en schakel over naar het helderveldkanaal (BF) met behulp van het 10x-objectief. Concentreer u op de geïmmobiliseerde druppels in BF en zorg ervoor dat het geheel in een perfect vlak wordt gemonteerd door rond te pannen en indien nodig aan te passen. Ga naar het midden van de kamer voor de volgende stappen. Activeer het geautomatiseerde scherpstelsysteem (PFS) en stel het in op het optimale meetvlak op het BF-kanaal, zodat druppelranden eruitzien als zwarte, scherpe cirkels die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van de oliefase en de achtergrond.OPMERKING: Metingen zijn ook mogelijk zonder een geautomatiseerd scherpstelsysteem, maar als de microscoop ermee is uitgerust, raden we ten zeerste aan om dit te gebruiken. Dit verbetert de meetkwaliteit voor grote en zwaar gestikte afbeeldingen. Doorloop alle fluorescentiekanalen en stel voor elk kanaal het optimale meetvlak in. Voor verplaatsingsmetingen op de FITC-, TRITC- en Cy5-kanalen, zorg ervoor dat het nanodeeltjesaggregaat perfect scherp is, voor het DAPI-kanaal zorg ervoor dat de cellen scherp zijn.OPMERKING: Optimale brandpuntsvlakken en z-waarden kunnen verschillen voor alle gemeten kanalen. Zorg ervoor dat u voor elk kanaal afzonderlijke PFS-offsets opslaat. Voordat u met de meting begint, doorloopt u alle kanalen om de afzonderlijke brandpunten te controleren en wacht u 5 minuten om in evenwicht te komen, aangezien er in eerste instantie beweging kan optreden terwijl de oplossingen opwarmen. Start de meting. Controleer na het genereren van de eerste afbeelding op eventuele onregelmatigheden (focus, bewegende druppels, verkeerde kanalen, enz.). Start de acquisitie indien nodig opnieuw, of vul in het geval van lucht de kamer opnieuw (begin bij stap 4.1.4). Laat het geheel de druppeltjes gedurende 4 uur in beeld brengen. 6. Analyse van het beeld Installeer beeldanalysesoftware (DropMap Analyzer App v 4.023) in MatLab (https://github.com/ESPCI-LCMD/MiMB) en breng het gegenereerde .nd2-bestand over van het experiment naar een analysecomputer. Open de applicatie. Selecteer de opgegeven instellingen, anders laat u de standaardwaarde geselecteerd: CH1: DAPI, WD (hele druppel); CH2: FITC, BL (beadline) geselecteerd; CH3: TRITC, BL geselecteerd; CH4: Cy5, BL geselecteerd; Maximale druppeldiameter (μm): 70; Valdetectie: vol; Volgen: Ja. Druk op de Start-knop (fruitpictogram) om de .nd2-bestandslocatie te selecteren en de analyse te starten. Na een paar minuten toont het programma een voorbeeldgedeelte van de afbeelding (Figuur 3A). Druk op de spatiebalk totdat u er een vindt die geschikt is voor druppeldetectie en druk vervolgens op Enter. Teken in hetzelfde afbeeldingsgedeelte een rechthoek in een representatief gebied voor het vinden van drempelparameters om druppels te detecteren. Na een paar minuten wordt een ander venster geopend met de intensiteitsverdeling van het DAPI-kanaal. Sleep de schuifregelaar om alleen het signaal van de bevlekte cellen te detecteren en klik op Gereed in de rechterbovenhoek. Na het segmenteren van het beeld in enkele druppels met diameters kleiner dan Max. Druppeldiameter (μm), voert het programma nu de volgende stappen uit voor elke druppel, elk tijdstip en elk fluorescentiekanaal zonder verdere invoer van de gebruiker (zie afbeelding 3).De software berekent de verplaatste pixels van de druppel tussen tijdstippen (druppels die meer dan 40 pixels bewegen, worden automatisch uitgesloten). De software meet de gemiddelde fluorescentiewaarde van de hele druppel, detecteert en meet de gemiddelde parellijnintensiteit door de helderste pixel op een horizontale lijn te vinden en het gemiddelde te nemen van alle pixelintensiteiten op een verticale lijn van boven naar beneden van de druppel. Dit gebeurt automatisch en wordt gebruikt om de gemiddelde verplaatsingswaarden van de hiellijn te berekenen (Figuur 3B) volgens de vergelijking: De software berekent het percentage van het totale aantal pixels in het druppelgebied boven de drempel die is ingesteld op het DAPI-kanaal. Het resulterende .xslx-bestand bevat de volgende kolommen die van belang zijn voor verdere analyse: DropIdX (ID van de druppel die in de loop van de tijd wordt gevolgd), TrueCentroid_ t*2-1 en t+2 (x- en y-coördinaten, respectievelijk, van het druppelcentrum voor tijdstip t), DiameterMicrons (druppeldiameter in μm), TrackingMove (aantal pixels verplaatst over de gehele meettijd), FluoChannel_BL_Ratio_t (verplaatsingswaarde voor FluoChannel op tijdstip t), DAPI_WD_PosPxlCount_t (aantal pixels boven de drempelwaarde in de hele druppel in het DAPI-kanaal op tijdstip t). Figuur 3: Beeldanalyse uitgevoerd door de beeldanalysesoftware. (A) Druppels worden gedetecteerd in het helderveldkanaal (BF) met behulp van een Hough-transformatie, waarbij elke druppel wordt gemarkeerd met een rode cirkel. Schaal balken: 200 μm. (B) Binnen elke druppel wordt de nanodeeltjesparellijn geïdentificeerd door de helderste pixels in het horizontale vlak en de fluorescentie-intensiteiten gemiddeld voor alle pixels die zich uitstrekken van boven naar beneden van de druppel. Bovendien wordt de cel geïdentificeerd door een pixelpercentage >0 boven de drempelwaarde voor het hele druppelgebied. Schaalbalk: 20 μm. (C) De analysatorsoftware vergelijkt de fluorescentie-intensiteit op de nanodeeltjes met de druppelachtergrond voor de FITC-, TRITC- en Cy5-kanalen over alle gemeten tijdstippen voor elke individuele druppel. Weergegeven zijn de tijdstippen 0, 4 (120 min) en 9 (240 min). Om handmatig te controleren op de juiste druppel- en celdetectie, worden ook de DAPI- en BF-kanalen weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 7. Kalibratie OPMERKING: Voor een kwantitatieve uitlezing moet de kalibratie van cytokineconcentraties naar fluorescentieverplaatsingswaarden één keer worden uitgevoerd, omdat er verschillen kunnen optreden tussen verschillende experimentele opstellingen. Alle vereiste stappen worden gedetailleerd beschreven in de vorige protocolsecties zoals verwezen. Bereid nanodeeltjes voor zoals beschreven in stap 2. Reconstitueer de humane recombinante eiwitten IL-6, TNFα en IL-1β volgens de instructies van de fabrikant.NOTITIE: Zorg ervoor dat ingevroren aliquots slechts één keer worden ontdooid en onmiddellijk worden gebruikt. Bereid een 2-voudige verdunningsreeks voor alle drie de eiwitten samen met behulp van volledige media (10% FBS, 1% Pen/Streptokokken, 25 mM HEPES) met een startconcentratie van 80 nM tot 0,625 nM. Voer de inkapseling uit zoals beschreven in stap 4 met gefunctionaliseerde nanodeeltjes in de eerste en RPMI pas in de tweede waterige fase. Deze meting dient als blanco en de gemeten standaarddeviatie wordt later gebruikt voor gegevensanalyse. Wacht 5 minuten en maak een foto van de druppels zoals beschreven in stap 5. Maak 3 foto’s met een arraygrootte van 2 x 2 in de respectievelijke fluorescentiekanalen. Herhaal stap 7.4 en 7.5 met alle bereide kalibratieoplossingen, beginnend met de laagste en eindigend met de hoogste concentratie. Analyseer de afbeeldingen zoals beschreven in stap 6. Gebruik de WD-optie niet voor het DAPI-kanaal en stel Tracking in op Nee. De analyse voert fluorescentieverplaatsingswaarden uit voor elke gemeten druppel in één beeld. Extraheer de mediaan en standaarddeviatie voor elk fluorescentiekanaal. Gemiddeld het gemiddelde van de mediaan en standaarddeviatie voor elk gemeten beeld per concentratie. Genereer een kalibratiecurve door de gemiddelde mediane verplaatsing uit te zetten tegen de gemeten concentraties van elk recombinant eiwit. Pas de curven aan met behulp van een eenfasige associatie: ,met Y = verplaatsing op x, Y0 = verplaatsing van blanco meting en x de gebruikte concentratie. De verkregen kalibratiecurve wordt gebruikt om de verplaatsingswaarden te kwantificeren zoals beschreven in stap 8.OPMERKING: Pas alleen waarden aan tot de hoogst gemeten verplaatsing en sluit waarden uit van hogere concentraties met een lagere gemeten verplaatsing. Een afname van de gemeten verplaatsingswaarden bij hogere concentraties is te verwachten en treedt op als gevolg van het Hook-effect en de beperkte bindingscapaciteit van de nanodeeltjes. 8. Gegevensanalyse Sluit druppels uit met een TrackingMove-waarde hoger dan 10, d.w.z. die in de loop van de meting meer dan 10 pixels hebben verplaatst. Identificeer druppels die gekleurde cellen bevatten (DAPI-kanaal) op het eerste tijdstip door te sorteren op druppels met waarden hoger dan 0 in de kolom DAPI_WD_PosPxlPercent_1. Identificeer druppeltjes die secreterende cellen bevatten door de volgende 3 criteria toe te passen op de fluorescentieverplaatsing van elk fluorescentiekanaal (FluoChannel_BL_Ratio_t kolommen).Identificeren van druppels met toenemende verplaatsingswaarden, door te sorteren op een positieve helling over de meettijd. Identificatie van druppeltjes met verplaatsingswaarden die de detectielimiet (LOD) bereiken. Een druppel wordt geselecteerd wanneer de maximale fluorescentieverplaatsing gedurende de meettijd groter is dan de LOD, berekend zoals elders beschreven25: , waarbij μVerplaatsing t0 de mediaan is van alle verplaatsingswaarden op tijdstip 0 en σBLK de standaarddeviatie van de blanco gemeten tijdens de kalibratie, elk cytokinespecifiek zijn. Verifiëren dat de toename van de verplaatsingswaarde significant is door te controleren of de verandering tussen de maximale en minimale gemeten fluorescentieverplaatsing gedurende de meettijd groter is dan: . Identificeer co-secreterende cellen door te voldoen aan de criteria beschreven in stap 8.3. voor meer dan één fluorescentiekanaal tegelijkertijd. Herhaal stap 8.3. voor alle druppels die geen cel bevatten (DAPI_WD_PosPxlPercent_1 = 0). Gebruik deze druppeltjes om het percentage fout-positieven te berekenen. Bepaal de nauwkeurige λ-waarde van de meting door willekeurig 200 – 500 druppels te selecteren en deze te inspecteren met de functie Verifiëren en sorteren van de beeldanalysesoftware. Tel het aantal cellen in deze druppeltjes en bereken:λ = aantal getelde cellen / aantal geanalyseerde druppeltjes Bereken het totale aantal ingekapselde cellen voor de meting door:Totaal celgetal = λ × aantal geanalyseerde druppeltjes Bereken het percentage afscheidende cellen aan de hand van het bepaalde celgetal. Bereken bovendien het fout-positieve percentage voor elke cytokine (meestal minder dan 3%-5% ten opzichte van het aantal echte positieven per kanaal) en gebruik ze als interne controle voor experimentele consistentie en reproduceerbaarheid. Om de uitgescheiden cytokineconcentraties te berekenen, converteert u de verplaatsingswaarden naar de concentratie met behulp van de vastgestelde kalibratievergelijkingen uit stap 7.10. Bereken de secretiesnelheid (SR) tussen tijdstippen met behulp van de volgende vergelijking. Bereken de gemiddelde secretiesnelheid over de meting door het gemiddelde te nemen van de afzonderlijke secretiesnelheden tussen tijdstippen. Als de maximaal meetbare verplaatsing vóór het einde van de meting is bereikt, stel dan de concentratie in op de maximaal meetbare concentratie (deze waarde is cytokinespecifiek en komt overeen met de maximale concentratie die is gemeten en gebruikt in de kalibratiecurve in stap 6.10) en bereken geen verdere concentratie. Bereken de secretiesnelheid en het gemiddelde alleen tot dit tijdstip.OPMERKING: Als er minder dan 50 secreterende cellen in één fluorescentiekanaal worden gedetecteerd, moeten de druppels visueel worden onderzocht via de verificatie- en sorteerfunctie en kunnen druppeltjes met fluorescentie- of nanodeeltjesaggregaten worden uitgesloten van de analyse. Om verdere parameters uit de secretiecurve van elke afzonderlijke cel te extraheren, voert u een kleinste kwadratische aanpassing uit aan de tijdconcentratiecurve voor elke cel en cytokine met behulp van een aangepast Python-script (beschikbaar op aanvraag). De passende functie is een sigmoïdale curve volgens de hieronder beschreven formule (past bij R2<0,95 is uitgesloten van de volgende stappen):waarbij C overeenkomt met het concentratieplateau [nM], t50 met de verschuiving van het halve maximum [s] en m met de heuvelhelling [min-1]. Uit deze parameters worden de volgende curvedescriptoren geëxtraheerd zoals hieronder beschreven.Cmax [nM]: Maximaal gemeten concentratie. : Tijdstip van aanvang van de secretie, waarbij de pasvorm 10% van C bereikt. : secretiesnelheid als de geschatte lineaire helling van de curve tussen 10% en 90% van de tijdconcentratiecurve.