Enfoque microfluídico para resolver la secreción simultánea y secuencial de citocinas de células polifuncionales individuales

Todos los experimentos se realizaron bajo el acuerdo de ética EK202-N-56 y fueron aprobados por la comisión de ética de ETH Zurich. La manipulación de las células humanas se realizó en una cabina de flujo laminar contenida en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad. NOTA: En las siguientes secciones se detalla el protocolo para medir la secreción de citocinas resueltas en el tiempo a nivel de una sola célula. El procedimiento descrito aquí se aplica a la estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con lipopolisacárido (LPS) y la medición paralela de las citocinas IL-6, TNFα e IL-1β. Sin embargo, si es necesario, el protocolo se puede adaptar a otros tipos de células, estimulantes y citoquinas. 1. Fabricación de la cámara de observación NOTA: Para evitar el movimiento de las gotas durante la toma de imágenes, se prepara una cámara de observación con una altura que es aproximadamente un 10% menor que el diámetro de la gota. Preparación de la cinta de corte de doble cara y la corredera de vidrio superiorDibuje o cargue el diseño deseado del recorte de la cámara en la pestaña Diseño del software de corte. Para conocer las dimensiones específicas utilizadas aquí, consulte la Figura 2E. Fije la cinta adhesiva de doble cara de 32 μm de grosor a la alfombrilla de corte adhesiva con cinta adhesiva y coloque la alfombrilla de corte en la máquina de corte automática. Corta el diseño de la cámara de la cinta, mientras prestas atención a cortar los bordes largos de la cámara en la misma dirección para facilitar el desprendimiento en el paso 1.3. Guarde los recortes de cinta a temperatura ambiente para almacenarlos a largo plazo. Para el almacenamiento a corto plazo, guárdelos a -20 °C y retírelos poco antes del paso 1.3. para facilitar su manejo. Taladre dos orificios de aproximadamente 1 mm de diámetro en el centro de un portaobjetos de microscopio estándar (76 mm x 26 mm x 1 mm), con una distancia entre los dos orificios de aproximadamente 3,5 cm. Limpieza y activación por plasma de portaobjetos de vidrioLimpie un portaobjetos de vidrio con agujeros y otro sin agujeros con jabón. Enjuague bien con agua destilada y seque con toallitas de precisión sin pelusa. Coloque los portaobjetos de vidrio en un limpiador de plasma y trate con plasma las superficies superiores a 55 W durante 10 minutos. Retire los portaobjetos de vidrio y continúe con el paso 1.3. Montaje de la cámaraColoque el portaobjetos de vidrio con orificios sobre una superficie limpia con el lado activado por plasma hacia arriba, sin tocar la superficie activada. Retire la capa protectora de un lado de la cinta adhesiva de doble cara, en la misma dirección de corte. Sin tocar, alinee el corte de la cinta con los bordes del portaobjetos de vidrio y los orificios perforados, y coloque lentamente la cinta en contacto con el portaobjetos de vidrio comenzando por el borde corto.NOTA: Preste atención a no generar estiramientos o pliegues en la cinta, ya que esto dará como resultado alturas de cámara incorrectas. Dado que este paso es propenso a errores y requiere cierta experiencia práctica, es aconsejable preparar varios portaobjetos de vidrio en paralelo. Retire la segunda capa protectora de la cinta, nuevamente en la dirección de corte, y coloque la segunda corredera de vidrio sin orificios con la superficie activada hacia abajo. Presione toda la superficie de los dos portaobjetos de vidrio colocando una tabla plana en la parte superior y presionando hacia abajo con la fuerza de la parte superior del cuerpo durante unos 10 s. Después de ensamblar las dos correderas de vidrio, voltee la cámara para que los dos orificios queden frente a usted. Pegue los nanopuertos a los dos orificios colocando una pequeña cantidad de pegamento curable por UV en el anillo debajo del puerto y colocando el puerto encima del orificio en el portaobjetos de vidrio. Agregue un anillo de pegamento curable UV alrededor del puerto y cure el pegamento con una lámpara UV. La cámara debería tener ahora el aspecto que se muestra en la Figura 2E. Continúe inmediatamente con el paso 1.4.NOTA: La luz ultravioleta puede dañar los ojos y la piel. Use el equipo de protección adecuado. Recubrimiento fluorófilo de la superficie de la cámaraNOTA: Este paso debe realizarse dentro de 1 h después del tratamiento con plasma de los portaobjetos de vidrio (paso 1.2.2) para garantizar una buena eficiencia del recubrimiento.Prepare 1 mL de solución de fluorosilano al 1% (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecirltriclorosilano) en aceite fluorado (HFE-7500) y llénelo en una jeringa. Empuje la solución de recubrimiento a través de un filtro de jeringa de PTFE y una aguja de 27G x 0,75 pulgadas conectada a un microtubo de PTFE de 0,3 mm x 0,76 mm, dentro de la cámara de observación. Después de 1 minuto de incubación, enjuague la solución de recubrimiento fuera de la cámara usando presión de nitrógeno bajo una campana extractora. Enjuague la cámara con aceite fluorado (solo HFE-7500) utilizando otro conjunto de jeringa. Guarde la cámara llena de aceite fluorado con entradas cerradas a temperatura ambiente (RT). Después de cada experimento, lave las células y las gotas directamente para garantizar una buena conservación del recubrimiento.NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, y las cámaras se pueden almacenar y reutilizar durante varios meses. Soporte de cámara con imanesPara la alineación de las nanopartículas magnéticas, aplique un campo magnético estático a la cámara de observación durante la encapsulación de gotas y la obtención de imágenes. Para ello, coloque la cámara en un soporte de microscopía personalizado impreso en 3D (véase la Figura 2D y el archivo que se encuentra en Bounab et al.17 Datos complementarios 4) que contiene dos imanes de neodimio a lo largo de los lados largos de la cámara. 2. Funcionalización de nanopartículas NOTA: El proceso de funcionalización de nanopartículas es similar para cada citocina, la única diferencia es la adición de anticuerpos de captura específicos de citocinas. La funcionalización de cada citocina se realiza en diferentes tubos de reacción individuales en paralelo. Antes de este protocolo, el anticuerpo de captura de TNFα y el anticuerpo de detección de IL-1β se marcaban internamente con biotina y Alexa Fluor 647, respectivamente. La conjugación se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante que se encuentra en el sitio web del proveedor (ver enlaces en la Tabla de Materiales) y los anticuerpos se alícuotas y almacenaron a -20 °C. Añadir 50 μL de nanopartículas funcionalizadas con estreptavidina (diámetro (Ø) 300 nm) en el tubo destinado a la detección de TNFα, 50 μL para la IL-1β y 100 μL para la IL-6. Diluir la solución de nanopartículas 1:1 (v/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir a cada tubo 1/20 (v/v) del volumen respectivo de los anticuerpos de captura biotinilados (concentraciones de stock de 0,5 mg/mL) e incubar durante 30 min en RT.NOTA: Cuando agregue pequeños volúmenes a la solución de nanopartículas, deposite el volumen en la parte superior del tubo y lávelo varias veces con la mayor parte de la solución. Esto asegura una mezcla adecuada y evita la formación de agregados. Añadir 1/100 (v/v) de 1 mM de solución de D-biotina al tubo e incubar durante 5 min a RT. Esto da como resultado una concentración final de biotina de 10 μM.NOTA: El exceso de biotina bloquea los lados de unión libre en las nanopartículas y reduce la formación de agregados no deseados. Recoja las partículas sosteniendo un imán de neodimio cerca del tubo. Espere hasta que el sobrenadante esté claro y deseche el sobrenadante.NOTA: Los imanes utilizados a lo largo del ensayo exhiben fuerzas de atracción muy fuertes, que pueden causar daños físicos si dos imanes se unen accidentalmente. Para reducir la adsorción inespecífica a la superficie de la nanopartícula, resuspenda inmediatamente las nanopartículas en 0,5 veces el volumen final del paso 2.1 de Pluronic F-127 (10%) y 0,5 veces el volumen PBS. Incubar la solución durante 30 min en RT. Recoja las partículas con el imán, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 vez el volumen del tampón de almacenamiento (RPMI 1640, 5% de reemplazo de suero knockout, 1% de Pen/Strep, 1% de albúmina sérica humana recombinante (HSA), 25 mM de HEPES, 0,1% de Pluronic F-127). Incubar la solución durante 30 min en RT.NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, y las partículas ahora se pueden almacenar hasta por 1 semana a 4 °C. Inmediatamente antes de la encapsulación, vuelva a suspender las partículas mediante pipeteo y mezcle las nanopartículas conjugadas en una proporción de 2:1:1 (v/v) para IL-6:TNFα:IL-1β, respectivamente.NOTA: Las diferentes proporciones de nanopartículas funcionalizadas dependen del par de anticuerpos utilizado para cada citocina y se han determinado experimentalmente a través de muestras de calibración para obtener un rango dinámico óptimo. Lavar con medios completos (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 25 mM HEPES) recogiendo las partículas con el imán, desechando el sobrenadante y volviendo a suspender. Repita este paso, pero vuelva a suspender solo en 0,5 veces el volumen de los medios completos del paso 2.7. Agregue los anticuerpos de detección IL-6, TNFα e IL-1β marcados de manera diferente a la solución para alcanzar una concentración final de 10 nM cada uno. La solución ya está lista para ser utilizada en los experimentos con gotas. 3. Preparación de la célula NOTA: Las PBMC se aislaron de un abrigo buffy recibido del banco de sangre de Zúrich. Las células se congelaron y se almacenaron en crioviales (1 x 107 células/vial) en nitrógeno líquido durante varios meses. Descongelación de células1 h antes de comenzar el experimento, deje que el medio completo y el tampón MACS (2 mM EDTA, 0,5% BSA en DPBS, filtrado estéril) se calienten en RT. Prepare el tubo que contiene las células añadiendo 9 mL de medio completo en un tubo de 15 mL y manteniéndolo en el baño de agua a 37 °C. Recupere un criovial PBMC (que contiene ~ 1 x 107 celdas) de su almacenamiento en nitrógeno líquido. Agite el tubo criogénico en el baño de agua a 37 °C hasta que solo quede una pequeña cantidad de hielo. Limpie el tubo con 70% de EtOH y transfiéralo a la cabina de flujo laminar. Añada 1 ml de medio completo precalentado al criovial, mezcle suavemente y transfiera todas las células al tubo que contiene el medio completo tibio. El criovial se puede lavar con 1 mL de medio completo tibio para recuperar el máximo número de células. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min en RT, desechar el sobrenadante y volver a suspender suavemente con una pipeta el pellet de células con 1 mL de medio completo. Agregue 9 mL de medio completo. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender como se ha hecho anteriormente en 1 mL de medio completo. Cuente las celdas usando el contador de celdas disponible. En este caso, se utilizó un contador de células automatizado. Las células se contaron mezclando 10 μL de suspensión celular con 10 μL de azul de tripán y transfiriendo 10 μL de la mezcla al portaobjetos de recuento celular. Tinción y bloqueo de FcRCalcule el número total de células y el volumen necesario para resuspender las células a 2 x 106 células vivas/mL. Prepare la solución de tinción celular (CellTrace Violet) diluyendo el material (5 mM) 1000 veces en PBS (concentración de trabajo de 5 μM). Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el volumen calculado de solución de tinción celular preparado en el paso 3.2.1. Incubar las células a 37 °C durante 5 min. Al final de la incubación, enfríe el colorante restante en la solución agregando medios completos (al menos 2 veces el volumen de la solución de tinte). Gire las celdas a 500 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en 60 μL de tampón MACS y agregue 20 μL de bloque de FcR humano por 1 x 107 células. Incubar las células durante 10 min en RT. Llene el tubo hasta 10 ml con MACS Buffer y centrifuga las células a 500 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio completo Cuente las células como se describe en el paso 3.1.6. Estimulación celular con LPSUsando el recuento de células, diluya las células a 1 x 106 células/mL y transfiera 2 mL de células a cada pocillo en una placa de 6 pocillos de unión ultrabaja. Diluya el LPS en medios completos y añádalo al pocillo que contiene las células para obtener una concentración final de LPS de 1 μg/mL. Incubar las células durante 6 h a 37 °C. Preparación para la encapsulaciónAl final del tiempo de estimulación, transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de 15 mL. Agregue 1 mL de medio completo en el pocillo vacío. Con un raspador de células, separe las células restantes. Transfiera las células a un nuevo tubo de 15 ml. Lave el pocillo con 1 mL de medio completo y transfiéralo a otro tubo de 15 mL. Centrifugar los dos tubos a 500 x g durante 5 min a RT y transferir 1 mL de la solución sobrenadante sin diluir (del primer tubo que contiene las células no lavadas) a un nuevo tubo para su posterior análisis si es necesario (p. ej., ELISA). Desecha el resto de los sobrenadantes. Vuelva a suspender los gránulos en 0,5 ml de medio completo, combine las células del mismo pocillo y transfiéralas a un tubo de centrífuga. Cuente las celdas como se describe en el paso 3.1.6. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a RT y desechar la mayor parte del sobrenadante (dejando aproximadamente 100 μL). Sin volver a suspender el pellet, agregue con mucho cuidado 200 μL de medio completo. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en medios completos a una concentración de 6,6 a 13,3 x 106 células/ml para lograr un número medio de células por gota de λ = 0,2-0,4 para la encapsulación, tal como se define en el paso 8.6.NOTA: Los pasos 3.4.6 y 3.4.7 deben realizarse inmediatamente antes de la encapsulación para evitar la secreción de citocinas en el sobrenadante. El número de células por gota sigue una distribución de Poisson: , donde P muestra la fracción de gotas que contienen X células y λ es el número medio de células por gota. 4. Encapsulación y producción de gotas NOTA: La encapsulación de células en gotas es posible mediante un chip generador de gotas microfluídicas, cuya fabricación se describe con gran detalle en otra parte17. Las alternativas están disponibles comercialmente (ver ejemplo en la Tabla de Materiales). Un diseño de chip generador de gotas adecuado tiene dos entradas para las fases acuosas, una entrada para la fase oleosa y una salida para las gotas generadas. Además, un chip generador de gotas comercial adecuado debería permitir la producción de agua en gotas de aceite fluorado de 40-60 pL de volumen. El protocolo descrito aquí da como resultado emulsiones de agua/aceite (gotas) con un diámetro de 50 μm. El uso de varias opciones para modificar el protocolo puede dar lugar a gotas más grandes o más pequeñas. Preparación de la bomba de jeringa (Figura 2A)Llene una jeringa de 1 ml con 500 μL de fase continua que consiste en un 2% de 008-tensioactivo fluorado en aceite fluorado HFE-7500. Conecte una aguja de 27G x 0,75 pulgadas a un microtubo de PTFE de 0,30 mm x 0,76 mm y monte el conjunto en la jeringa y, posteriormente, en la bomba de jeringa.NOTA: Asegúrese de que no quede aire en la jeringa o cánula, ya que esto evita que los caudales sean constantes. Prepare dos conectores de punta de pipeta hechos a medida para las fases acuosas (Figura 2B): Haga un orificio con un punzón de biopsia de Ø0,75 mm en el centro de un recorte de PDMS de ~5 mm de altura con Ø6 mm. Tire de ~3 cm de tubo de PTFE (0,56 mm de diámetro interior, 1,07 mm de diámetro exterior) a través del orificio del recorte del PDMS y empuje el conjunto hacia la parte superior de una punta de pipeta de 200 μL. Conecte el otro lado del tubo a una aguja de 23Gx 1.25 pulgadas. Selle el conector esparciendo pegamento curable por UV sobre la pipeta y cúrelo con luz UV.NOTA: Dado que la luz ultravioleta es dañina para los ojos, use gafas que bloqueen los rayos UV para protegerse. Llene dos jeringas de 1 ml con 500 μl de aceite mineral ligero, conecte dos agujas de 23 g con los accesorios hechos a medida y monte ambas en la bomba de jeringa. Aspire 30 μL de nanopartícula y 30 μL de solución celular en las puntas de pipeta de las fases acuosas utilizando el software de control de la bomba de jeringa. Prepare una cámara de observación limpiando la superficie con agua para eliminar la suciedad y el polvo y séquela con toallitas de precisión. Sujete la cámara en el soporte de cámara impreso equipado con dos imanes de neodimio.NOTA: Asegúrese de que los imanes apunten en la dirección correcta (atrayéndose entre sí) para formar un agregado alargado. Inclinar ligeramente la cámara (30°). Abra ambos puertos y conecte una toalla de papel en el puerto superior para absorber el exceso de fase exterior durante el llenado. Producción de gotas y llenado de cámarasConecte la fase continua a través de un tubo a la entrada superior del chip microfluídico (Figura 2A, C, F). Enjuague la viruta durante unos 30 s con fase continua utilizando un caudal de 1800 μL/h. Conecte las puntas de pipeta de las soluciones acuosas a las dos entradas intermedias (Figura 2A, C, F). Inicie el flujo de la solución acuosa con 200 μL/h cada uno y deje que los canales y la salida se llenen de líquido. Cuando se utilizan nanopartículas magnéticas, una solución homogénea de color marrón rojizo debe salir de la salida del chip. Una vez que el líquido aparezca en la salida, inicie el flujo de la fase oleosa fluorada a 800 μL/h y espere hasta que se establezca una producción de gotas estable, confirmada por la salida de una solución homogénea, gris y brillante en la salida. Una vez que se establece una producción estable de gotas, recoja las gotas producidas conectando microtubos de PTFE (0,3 mm de diámetro interior x 0,76 mm de diámetro exterior) al puerto de salida y diríjalos a una cámara de observación pasando el microtubo a través del módulo de férula de un accesorio de una sola pieza apretado con los dedos (Figura 2A). Si se produce una producción adecuada de gotas, un líquido homogéneo y brillante debe llenar la cámara con un frente recto de abajo hacia arriba. Una vez que la cámara esté llena, detenga el flujo y cierre los puertos con tapones de puerto usando una presión apretada con los dedos.NOTA: Preste atención a no cerrar la cámara demasiado herméticamente. El atrapamiento o la afluencia de aire pueden provocar movimientos de las gotas y, por lo tanto, comprometer el seguimiento durante la medición. Después de la producción de gotas, enjuague el chip con aceite fluorado y sople cualquier recordatorio de líquido con nitrógeno para preservar su función. Los chips se pueden reutilizar varias veces y almacenar durante meses, siempre que no se obstruyan. Figura 2: Descripción general de la configuración microfluídica. (A) Configuración para la encapsulación de gotas con la bomba de jeringa, el chip de generación de gotas y la cámara de observación y el soporte del microscopio. (B) Imagen del conector PDMS perforado (arriba) para formar un conector a una punta de pipeta de 200 μL (abajo), como se describe en el paso del protocolo 4.1.2. (C) Imágenes de la conexión de los tubos y las puntas de pipeta al chip de generación de gotas. (D) Imagen de la cámara colocada dentro del soporte de microscopio personalizado impreso en 3D con dos imanes en la parte superior e inferior. (E) Foto de la cámara de observación (con cinta blanca a modo de ilustración). (F) Disposición del chip microfluídico para la creación de gotas (barra de escala: 750 μm). Esta cifra ha sido modificada de17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. Adquisición y medición de imágenes NOTA: La adquisición de imágenes se realiza en un microscopio de epifluorescencia invertida estándar encerrado en una incubadora, lo que permite mediciones a 37 °C. Los ajustes aquí descritos son específicos para un microscopio Nikon Eclipse Ti2 que funciona con el software NIS Elements (V. 5.30.04) equipado con una cámara Orca Fusion, pero generalmente se adaptan a cualquier otro microscopio y cámara de fluorescencia. Ajuste de los parámetros de mediciónPara establecer el tamaño de la imagen, seleccione un tamaño de matriz de 10 x 10 imágenes. Esta matriz contendrá aproximadamente entre 50.000 y 70.000 gotas. Utilice una superposición del 1% y active la fusión para la unión de imágenes. Para establecer el número de canales medidos, seleccione el canal DAPI para la detección de células, FITC, TRITC, los canales Cy5 para la detección de citocinas (beadlines) y el canal BF para la detección de gotas. Utilice la agrupación en bins de píxeles 2 x 2 y 16 bits para la profundidad de bits. Adapte la configuración de la cámara para lograr valores de píxeles de intensidad en gota que no alcancen el máximo de la cámara para cada canal de fluorescencia.NOTA: Los tiempos de exposición exactos y las intensidades de lámpara para cada canal dependen del modelo y los reactivos utilizados y se establecen antes de generar las curvas de calibración (paso 7). El uso de los mismos ajustes de adquisición en la calibración y las mediciones de celdas es importante para una cuantificación precisa. Para configurar la medición resuelta en el tiempo, seleccione una medición cada 30 minutos para un total de 9 mediciones.NOTA: Los parámetros de medición pueden diferir para las células utilizadas, los estimulantes, los reactivos, las citocinas medidas, la temperatura de incubación y los modelos de microscopio. Inicio de la mediciónMonte el soporte de la cámara en el microscopio con una platina de formato de placa de pocillo (Figura 2D) y cambie al canal de campo claro (BF) utilizando el objetivo 10x. Concéntrese en las gotas inmovilizadas en BF y asegúrese de que el conjunto esté montado en un plano perfecto girando y ajustando si es necesario. Muévase al centro de la cámara para los pasos siguientes. Active el sistema de enfoque automático (PFS) y ajústelo al plano de medición óptimo en el canal BF para que los bordes de las gotas aparezcan como círculos negros y nítidos que se puedan distinguir fácilmente de la fase oleosa y el fondo.NOTA: Las mediciones también son posibles sin un sistema de enfoque automatizado, pero si el microscopio está equipado con uno, recomendamos encarecidamente usarlo. Esto mejora la calidad de medición de imágenes grandes y muy unidas. Recorra todos los canales de fluorescencia y establezca el plano de medición óptimo para cada uno. Para las mediciones de reubicación en los canales FITC, TRITC y Cy5, asegúrese de que el agregado de nanopartículas esté perfectamente enfocado, para el canal DAPI, asegúrese de que las celdas estén enfocadas.NOTA: Los planos focales óptimos y los valores z pueden diferir para todos los canales medidos. Asegúrese de guardar los desplazamientos PFS individuales para cada canal. Antes de comenzar la medición, revise todos los canales para verificar los focos individuales y espere 5 minutos para equilibrar, ya que puede ocurrir movimiento inicialmente mientras las soluciones se calientan. Inicie la medición. Después de generar la primera imagen, compruebe si hay irregularidades (enfoque, gotas en movimiento, canales incorrectos, etc.). Reinicie la adquisición si es necesario, o en el caso de aire, vuelva a llenar la cámara (comience desde el paso 4.1.4). Deje que el ensamblaje muestre las gotas durante 4 h. 6. Análisis de imágenes Instale el software de análisis de imágenes (DropMap Analyzer App v 4.023) en MatLab (https://github.com/ESPCI-LCMD/MiMB) y transfiera el archivo .nd2 generado desde el experimento a un equipo de análisis. Abra la aplicación. Seleccione la configuración especificada, de lo contrario, deje el valor predeterminado: CH1: DAPI, WD (gota entera) seleccionado; CH2: FITC, BL (línea de cuentas) seleccionados; CH3: TRITC, BL seleccionados; CH4: Cy5, BL seleccionado; Diámetro máximo de caída (μm): 70; Detección de caídas: Completo; Seguimiento: Sí. Pulse el botón Inicio (icono de fruta) para seleccionar la ubicación del archivo .nd2 e iniciar el análisis. Después de unos minutos, el programa mostrará una sección de ejemplo de la imagen (Figura 3A). Presione la barra espaciadora hasta que encuentre uno adecuado para la detección de gotas, luego presione Enter. En la misma sección de la imagen, dibuje un rectángulo en un área representativa para encontrar parámetros de umbral para detectar gotas. Después de unos minutos, se abrirá otra ventana que muestra la distribución de intensidad del canal DAPI. Arrastre y suelte el control deslizante para detectar solo la señal de las células manchadas y haga clic en Listo en la esquina superior derecha. Después de segmentar la imagen en gotas individuales con diámetros menores que el diámetro máximo de gota (μm), el programa ahora realizará los siguientes pasos para cada gota, punto de tiempo y canal de fluorescencia sin más intervención del usuario (consulte la Figura 3).El software calcula los píxeles movidos de la gota entre puntos de tiempo (las gotas que se mueven más de 40 píxeles se excluyen automáticamente). El software mide el valor medio de fluorescencia de toda la gota, detectando y midiendo la intensidad media de la línea de perlas encontrando el píxel más brillante en una línea horizontal y promediando todas las intensidades de píxeles en una línea vertical de arriba a abajo de la gota. Esto se hace automáticamente y se utiliza para calcular los valores promedio de reubicación de la línea de cuentas (Figura 3B) de acuerdo con la ecuación: El software calcula el porcentaje del total de píxeles en el área de la gota por encima del umbral establecido en el canal DAPI. El archivo .xslx resultante contendrá las siguientes columnas de interés para un análisis más detallado: DropIdX (ID de la gota rastreada a lo largo del tiempo), TrueCentroid_ t*2-1 y t+2 (coordenadas x e y, respectivamente, del centro de la gota para el punto de tiempo t), DiameterMicrons (diámetro de la gota en μm), TrackingMove (número de píxeles movidos durante todo el tiempo de medición), FluoChannel_BL_Ratio_t (valor de reubicación para FluoChannel en el punto de tiempo t), DAPI_WD_PosPxlCount_t (número de píxeles por encima del umbral en toda la gota en el canal DAPI en el punto de tiempo t). Figura 3: Análisis de imágenes realizado por el software de análisis de imágenes. (A) Las gotas se detectan en el canal de campo claro (BF) utilizando una transformación de Hough, marcando cada gota con un círculo rojo. Barras de escala: 200 μm. (B) Dentro de cada gota, la línea de perlas de nanopartículas se identifica a través de los píxeles más brillantes en el plano horizontal y las intensidades de fluorescencia promediadas para todos los píxeles que abarcan de arriba a abajo de la gota. Además, la celda se identifica a través de un porcentaje de píxeles >0 por encima del umbral para toda el área de la gota. Barra de escala: 20 μm. (C) El software del analizador compara la intensidad de fluorescencia de las nanopartículas con el fondo de las gotas para los canales FITC, TRITC y Cy5 en todos los puntos de tiempo medidos para cada gota individual. Se muestran los puntos de tiempo 0, 4 (120 min) y 9 (240 min). Para comprobar manualmente la correcta detección de gotas y células, también se muestran los canales DAPI y BF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 7. Calibración NOTA: Para una lectura cuantitativa, la calibración de las concentraciones de citocinas a los valores de reubicación de fluorescencia debe realizarse una vez, ya que pueden ocurrir diferencias entre diferentes configuraciones experimentales. Todos los pasos necesarios se detallan en las secciones de protocolo anteriores a las que se hace referencia. Prepare las nanopartículas como se describe en el paso 2. Reconstituya las proteínas recombinantes IL-6, TNFα e IL-1β humanas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.NOTA: Asegúrese de que las alícuotas congeladas se descongelen solo una vez y se usen con prontitud. Prepare una serie de diluciones de 2 veces para las tres proteínas juntas utilizando medios completos (10% FBS, 1% Pen/Strep, 25 mM HEPES) con una concentración inicial de 80 nM hasta 0,625 nM. Realice la encapsulación como se describe en el paso 4 con nanopartículas funcionalizadas en la primera y RPMI solo en la segunda fase acuosa. Esta medición sirve como blanco y la desviación estándar medida se utiliza para el análisis de datos posterior. Espere 5 minutos y obtenga una imagen de las gotas como se describe en el paso 5. Tome 3 imágenes con un tamaño de matriz de 2 x 2 en los respectivos canales de fluorescencia. Repita los pasos 7.4 y 7.5 con todas las soluciones de calibración preparadas, comenzando con la concentración más baja y terminando con la concentración más alta. Analice las imágenes como se describe en el paso 6. No utilice la opción WD para el canal DAPI y establezca Tracking en No. El análisis genera valores de reubicación de fluorescencia para cada gota medida en una imagen. Extraiga la mediana y la desviación estándar de cada canal de fluorescencia. Promedie la mediana y la desviación estándar de cada imagen medida por concentración. Genere una curva de calibración trazando la reubicación mediana promediada frente a las concentraciones medidas de cada proteína recombinante. Ajuste las curvas mediante una asociación monofásica: ,con Y = reubicación en x, Y0 = reubicación de la medición en blanco y x la concentración utilizada. La curva de calibración obtenida se utiliza para cuantificar los valores de reubicación como se describe en el paso 8.NOTA: Solo ajuste los valores hasta la reubicación medida más alta y excluya los valores de concentraciones más altas con una reubicación medida más baja. Se espera una disminución en los valores de reubicación medidos a concentraciones más altas, y se produce debido al efecto Hook y a la limitada capacidad de unión de las nanopartículas. 8. Análisis de datos Excluya las gotas con un valor de TrackingMove superior a 10, es decir, que se hayan movido más de 10 píxeles durante el transcurso de la medición. Identifique las gotas que contienen células teñidas (canal DAPI) en el primer punto de tiempo ordenando las gotas con valores superiores a 0 en la columna DAPI_WD_PosPxlPercent_1. Identifique las gotas que contienen células secretoras aplicando los siguientes 3 criterios a la reubicación de fluorescencia de cada canal de fluorescencia (columnas FluoChannel_BL_Ratio_t).Identificación de gotas con valores de reubicación crecientes, mediante la clasificación de una pendiente positiva durante el tiempo de medición. Identificación de gotas con valores de reubicación que alcanzan el límite de detección (LOD). Se selecciona una gota cuando la reubicación máxima de fluorescencia a lo largo del tiempo de medición es superior a la LOD, calculada como se describe en la parte25: , donde μReubicación t0 es la mediana de todos los valores de reubicación en el punto de tiempo 0 y σBLK la desviación estándar del blanco medidos durante la calibración, cada uno de ellos es específico de la citocina. Verificar que el aumento en el valor de reubicación es significativo comprobando que el cambio entre la reubicación de fluorescencia máxima y mínima medida durante el tiempo de medición es superior a: . Identifique las células cosecretoras cumpliendo los criterios descritos en el paso 8.3. para más de un canal de fluorescencia simultáneamente. Repita el paso 8.3. para todas las gotas que no contengan ninguna célula (DAPI_WD_PosPxlPercent_1 = 0). Utilice estas gotas para calcular el porcentaje de falsos positivos. Determine el valor λ preciso de la medición seleccionando aleatoriamente de 200 a 500 gotas e inspeccionándolas con la función Verificar y clasificar del software de análisis de imágenes. Cuente el número de células de estas gotas y calcule:λ = número de células contadas / número de gotas analizadas Calcule el número total de celdas encapsuladas para la medición mediante:Recuento total de células = λ × número de gotas analizadas Calcule el porcentaje de células secretoras utilizando el recuento de células determinado. Además, calcule el porcentaje de falsos positivos para cada citocina (generalmente menos del 3%-5% en relación con el número de positivos reales por canal) y utilícelos como control interno para la consistencia experimental y la reproducibilidad. Para calcular las concentraciones de citocinas secretadas, convierta los valores de reubicación en concentración utilizando las ecuaciones de calibración establecidas en el paso 7.10. Calcule la tasa de secreción (SR) entre puntos de tiempo utilizando la siguiente ecuación. Calcule la tasa de secreción promedio durante la medición promediando las tasas de secreción individuales entre puntos de tiempo. Si se alcanzó la reubicación máxima medible antes del final de la medición, ajuste la concentración a la concentración máxima medible (este valor es específico de la citocina y corresponde a la concentración máxima medida y utilizada en la curva de calibración en el paso 6.10) y no calcule más concentración. Calcule la tasa de secreción y el promedio solo hasta este punto de tiempo.NOTA: Si se detectan menos de 50 células secretoras en un canal de fluorescencia, las gotas deben examinarse visualmente a través de la función de verificación y clasificación y las gotas que tengan agregados de fluorescencia o nanopartículas se pueden excluir del análisis. Para extraer más parámetros de la curva de secreción de cada célula, realice un ajuste de mínimos cuadrados a la curva de tiempo-concentración para cada célula y citocina utilizando un script de Python personalizado (disponible a pedido). La función ajustada es una curva sigmoidal siguiendo la fórmula que se describe a continuación (los ajustes con R2<0,95 se excluyen de los siguientes pasos):donde C corresponde a la meseta de concentración [nM], t50 al desplazamiento del semimáximo [s] y m a la pendiente del cerro [min-1]. A partir de estos parámetros, se extraen los siguientes descriptores de curva como se describe a continuación.Cmax [nM]: Concentración máxima medida. : Momento de inicio de la secreción, donde el ajuste alcanza el 10% de C. : tasa de secreción como la pendiente lineal aproximada de la curva entre el 10% y el 90% de la curva de tiempo-concentración.