Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Aline Linder; Kevin Portmann; Luca Johannes Schlotheuber; Alessandro Streuli; Wiona Sophie Gl&#228;nzer; Klaus Eyer; Ines L&#252;chtefeld

doi:10.3791/66492

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

גישה מיקרופלואידית לפתרון הפרשת ציטוקינים סימולטנית ורציפה של תאים רב-תפקודיים בודדים

Published: March 08, 2024

doi:

10.3791/66492

Aline Linder*¹, Kevin Portmann*¹, Luca Johannes Schlotheuber¹, Alessandro Streuli¹, Wiona Sophie Glänzer¹, Klaus Eyer^1,2, Ines Lüchtefeld^1,3

¹Laboratory for Functional Immune Repertoire Analysis, Institute of Pharmaceutical Sciences, Department of Chemistry and Applied Biosciences,ETH Zürich, ²Department of Biomedicine,Aarhus University, ³Laboratory for Tumor and Stem Cell Dynamics, Institute of Molecular Health Sciences, Department of Biology,ETH Zürich

Summary

הפרוטוקול מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית מתקדמת למדידה כמותית של דינמיקת הפרשת ציטוקינים של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים בודדים. הפלטפורמה מודדת עד שלושה ציטוקינים במקביל (IL-6, TNFα ו-IL-1β) עבור כל תא בודד המגורה באמצעות ליפופוליסכריד כדוגמה.

Abstract

זיהומים, מחלות אוטואימוניות, תגובות אימונולוגיות רצויות ושליליות לטיפול יכולים להוביל לתגובת ציטוקינים מורכבת ודינמית in vivo. תגובה זו מערבת תאי חיסון רבים המפרישים ציטוקינים שונים כדי לתזמר את התגובה החיסונית. עם זאת, דינמיקת ההפרשה, הכמויות וההתרחשות המשותפת של הציטוקינים השונים על ידי תת-סוגים שונים של תאים עדיין אינם מובנים כראוי בשל היעדר כלים מתאימים לחקור אותם. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול באמצעות פלטפורמת טיפות מיקרופלואידית המאפשרת מדידה כמותית של דינמיקת הפרשה של מספר ציטוקינים במקביל ברמת התא הבודד. זה מתאפשר על ידי אנקפסולציה של תאים בודדים לתוך טיפות מיקרופלואידיות יחד עם immunoassay multiplexed לכימות מקביל של ריכוזי ציטוקינים, immobilization שלהם עבור הדמיה פלואורסצנטית דינמית, וניתוח של התמונות בהתאמה כדי להפיק כמויות מופרשות ודינמיקה. הפרוטוקול מתאר את הכנת ננו-חלקיקים מגנטיים מתפקדים, ניסויי כיול, הכנת תאים ואנקפסולציה של תאים וננו-חלקיקים לטיפות לצורך הדמיה פלואורסצנטית וניתוח תמונה ונתונים לאחר מכן תוך שימוש בדוגמה של תאים חד-גרעיניים אנושיים היקפיים בעלי גירוי ליפופוליסכרידי. הפלטפורמה המוצגת זיהתה התנהגות הפרשת ציטוקינים מובהקת עבור תאים בודדים ומפרישים במשותף, המאפיינת את ההטרוגניות הפנוטיפית הצפויה בדגימת התא הנמדדת. יתר על כן, האופי המודולרי של הבדיקה מאפשר את הסתגלותו ויישומו לחקר מגוון חלבונים, ציטוקינים ודגימות תאים, מה שעשוי להוביל להבנה עמוקה יותר של יחסי הגומלין בין סוגי תאי חיסון שונים ותפקידם של הציטוקינים השונים המופרשים באופן דינמי לעצב את התגובה החיסונית המווסתת היטב. תובנות חדשות אלה יכולות להיות מעניינות במיוחד במחקרים על חוסר ויסות חיסוני או בזיהוי אוכלוסיות יעד בטיפול ופיתוח תרופות.

Introduction

זיהומים גורמים לעתים קרובות לתגובות מארח מורכבות המערבות את מערכת החיסון המולדת והנרכשת ^1,2. עם הדבקה או זיהוי של גורמים זיהומיים, תאים מארחים יכולים לייצר מגוון רחב של כימותרפיה וציטוקינים, שהם חלבונים קטנים הידועים כמתקשרים קריטיים ומודולריים של מערכת החיסון³. ציטוקינים מעודדי דלקת משתחררים מוקדם לאחר ההדבקה כדי ליזום את התגובה החיסונית, ולאחר מכן ציטוקינים אנטי דלקתיים, שהם קריטיים למניעת נזק לרקמות ומחלות כרוניות או אוטו-דלקתיות לאחר מכן. איזון זה בין סילוק איומים לבין הגנה על רקמות מתבטא ברפרטואר רחב של ציטוקינים המפעילים תפקידים שונים במהלך הזיהום, ומאפשר כוונון עדין של התגובה ^4,5. בתוך תערובת זו ניתן להבחין בחתימות ייחודיות בהתאם לפתוגן ולאותות שהוא מעורר, מיקום הרקמה ותאי החיסון שמהם הם מגיעים. עם זאת, נראה כי שחרור ציטוקינים מהווה גם תהליך ביולוגי רב-תפקודי ייחודי לכל אוכלוסיית תאים, מגוון בדינמיקת ההפרשה ובתגובה האישית. הטרוגניות זו תוארה בספרות במשך שנים רבות, למשל, בקרב תת-אוכלוסיות^{תאי T} ^6,7, שם חקירות של מחלות אוטו-דלקתיות וזיהומים חמורים של COVID-19 הציגו מגוון תפקודי גדול של סמנים דלקתיים בתוך ובין חולים ^8,9. לאחרונה, הופעתו של ריצוף חד-תאי הדגישה את הפלסטיות הגבוהה ואת ההצלבות בין תת-אוכלוסיות בתוך מיקרו-סביבות חיסוניות שלא נראו קודם לכן, מה שמצביע על כך ששיטות חד-תאיות נחוצות כדי ללכוד הטרוגניות זו^10,11. בעוד שיטות חדשניות מפותחות לניתוח התעתוק, ניתוח פנוטיפי נותר מאתגר, מכיוון שהדבר דורש מדידות סימולטניות, כמותיות ופתורות בזמן של הפרשת חלבונים ברמה של תא יחיד. מדידות כאלה מאפשרות לנו לחקור הפרשת זהויות תאים, דינמיקה ודפוסי הפרשה (איטי/מהיר, מוקדם/מאוחר, סימולטני/רציף) עבור רפרטואר או פאנל של ציטוקינים. על ידי מתן אפשרות לחקור את הדינמיקה של שחרור ציטוקינים במהלך תגובה חיסונית באופן כמותי וברזולוציה טמפורלית, התובנות המתקבלות עשויות לאפשר הבנה של ההרכב התאי והתגובה המושרה.

בפרוטוקולים סטנדרטיים, ציטוקינים מזוהים בדרך כלל בסופרנאטנט של תרחיף תאים וסרום באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), המניבה כמויות המופרשות בתפזורת. מדידות בתפזורת אינן מאפשרות לכמת את כמויות הציטוקינים המיוצרות על ידי כל תא, בעיה המודגשת במיוחד בדגימות תאים הטרוגניות. שיטות חלופיות כגון צביעת ציטוקינים תוך תאית, בדיקת אימונוספוט מקושר אנזים (ELISpot) או בדיקות מיקרו-חרוטות (למשל, איזופלקסיס) מזהות ציטוקינים המבוטאים על ידי תאים בודדים, אך מספקות מדידות נקודות קצה רק^12,13. משמעות הדבר היא שמתעלמים מדינמיקת ההפרשה ומשינויים שעלולים להתרחש בדפוס ההפרשה התאית לאורך זמן הדגירה. בנוסף, מדידות בנקודות קצה אינן יכולות להבדיל בין הפרשת ציטוקינים בו זמנית לבין הפרשת ציטוקינים רציפה, ולכן ההיקף האמיתי של פולי-פונקציונליות בו זמנית של תאי מערכת החיסון בהפרשת ציטוקינים עדיין אינו ברור באמצעות שיטות אלה.

ניתן להשיג רזולוציה של תא בודד באמצעות מיקרופלואידיקה טיפתית כדי ליצור ולעבד תאים פיזיים בגודל פיקוליטר על מנת לחקור תאים חיסוניים על פנוטיפים ייחודיים של הפרשת ציטוקינים ברמת תא בודד^14,15. תאים אלה מורכבים מתחליבים של מים בשמן וניתן לייצר אותם באמצעות שבבים מיקרופלואידים^16,17. ואכן, בדיקות מיקרופלואידיות מבוססות טיפות הוכיחו רבגוניות קיצונית בכך שהן מאפשרות ניתוח של דגימות ורפרטוארים ביולוגיים שונים ברמת התא הבודד ושילובם עם תהליכים במעלה הזרם (עיבוד תאים ומגיבים) ובמורד הזרם (מיון תא יחיד, פרוטאומיקה או ריצוף)18,19,20,21,22. בפרט, תצורות המאפשרות אימוביליזציה של טיפות מאפשרות מדידה של פונקציונליות של תא בודד לאורך זמן, דבר בעל ערך לניתוח הפרשת חלבונים¹⁸. יתר על כן, שילוב בדיקות כמותיות מרובות מאפשר חקירות נוספות בממדים שלא היו נגישים בעבר, לתהליכים כגון הפרשה משותפת וזיהוי תאי חיסון רב-תפקודיים^23,24.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים זרימת עבודה חד-תאית מבוססת טיפות משותקות כדי לזהות, לכמת ולמדוד באופן זמני את ההפרשה של עד שלושה ציטוקינים במקביל מתאים בודדים^17,23. הטכנולוגיה מציעה יכולת לנטר תגובות ציטוקינים מלמעלה מ-20,000 תאים במקביל.

זרימת העבודה המוצגת מורכבת מאנקפסולציה מיקרופלואידית של תאי חיסון בודדים וננו-חלקיקים מתפקדים לטיפות מים בשמן של 60 pL. אימוביליזציה של >100,000 טיפות בתא תצפית ומיקרוסקופ פלואורסצנטי שנפתר בזמן מאפשרים מדידה של דינמיקת הפרשת ציטוקינים בתוך כל טיפה וכל ציטוקין (איור 1A). עבור כל תא בודד בתוך טיפה, הפרשת הציטוקינים נמדדת על-ידי אימונואסיית סנדוויץ’, שבה ננו-חלקיקים מגנטיים המתפקדים עם נוגדן לכידה ספציפי קושרים את הציטוקין המופרש, מה שמוביל לאחר מכן למיקום מחדש ולקשירה של נוגדני זיהוי המסומנים באופן פלואורסצנטי (איור 1B,C). קו חרוז נוצר על ידי יישור הננו-חלקיקים המגנטיים, שאליהם ניתן לכמת מיקום פלואורסצנטי בנוכחות ציטוקין. כאן, העתקת פלואורסצנטיות מוגדרת כעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת המצויה על קו החרוזים חלקי עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של הטיפה הנותרת. בדיקה זו יכולה להיות מרובבת עבור מספר ציטוקינים על ידי ערבוב אצוות ננו-חלקיקים מתפקדות שונות ונוגדני זיהוי בהתאמה המסומנים בתעלות פלואורסצנטיות שונות²³, וכתוצאה מכך מיקומים פלואורסצנטיים ספציפיים בתעלות השונות. בעזרת סקריפט ניתוח מותאם אישית, ניתן לחלץ ערכי רילוקיישן פלואורסצנטיים, ולהמיר את התמונות לפרופילים דינמיים של הפרשה עבור כל תא וציטוקין בודדים. לכן, מערכי הנתונים המתקבלים מניבים קריאות רבות, כגון מדידת ההפרשה הכמותית לאורך זמן, זיהוי תת-אוכלוסיות מפרישות משותפות, והתפלגות התאים לפי כמויות מופרשות, שיעורים וצירופים של ציטוקינים.

איור 1: עקרון זרימת העבודה והבדיקה. (A) סקירה כללית של זרימת העבודה לניתוח תאים מפרישי ציטוקינים לאחר גירוי. מתלים חד-תאיים וננו-חלקיקים מגנטיים מוכנים ונארזים ל-60 pL בנפח שמן/תחליב מים (טיפות). טיפות משותקות וננו-חלקיקים מיושרים בתוך שדה מגנטי לפני מדידה של עד 4 שעות כל 30 דקות. לבסוף, התמונות מנותחות, ואת הפרמטרים עבור כל טיפה, נקודת זמן ערוץ פלואורסצנטי מופקים. נתון זה שונה^מ-17. (B) עקרון הביואסייה של כריך טיפתי. ננו-חלקיקים פונקציונליים קושרים את הציטוקינים המופרשים, מה שמוביל לאחר מכן למעבר של נוגדני זיהוי המסומנים באופן פלואורסצנטי לננו-חלקיקים. מיקום מחדש זה של פלואורסצנטיות מכומת ומאומת באמצעות ניסויי כיול שבוצעו עם ציטוקינים רקומביננטיים. ערבוב ננו-חלקיקים פונקציונליים שונים מאפשר מדידות מרובות של עד שלושה ציטוקינים בו זמנית. (C) בניסויים מבוססי תאים, עוקבים אחר טיפות לאורך זמן המדידה, ותאים מפרישים מזוהים על-ידי עלייה בשעות נוספות של העברת פלואורסצנטיות אל הננו-חלקיקים. סכמות אינן עומדות בקנה מידה. איור שנוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

כל הניסויים בוצעו תחת הסכם אתיקה EK202-N-56 ואושרו על ידי ועדת האתיקה של ETH ציריך. הטיפול בתאים אנושיים בוצע בארון זרימה למינרי הכלול במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2. הערה: הסעיפים הבאים מפרטים את הפרוטוקול למדידת הפרשת ציטוקינים שנפתרה בזמן ברמת תא יחיד. ההליך המתואר כאן מיושם על גירוי של תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם (PBMC) עם ליפופוליסכריד (LPS) ומדידה מקבילה של הציטוקינים IL-6, TNFα ו- IL-1β. עם זאת, במידת הצורך, ניתן להתאים את הפרוטוקול לסוגי תאים אחרים, ממריצים וציטוקינים. 1. ייצור תא תצפית הערה: כדי למנוע תזוזה של הטיפות במהלך ההדמיה, מכינים תא תצפית בגובה הקטן בכ-10% מקוטר הטיפה. הכנת סרט החיתוך הדו צדדי ושקופית הזכוכית העליונהצייר או טען את העיצוב הרצוי של מגרעת התא בכרטיסייה עיצוב של תוכנת החיתוך. עבור הממדים הספציפיים שבהם נעשה שימוש כאן, ראו איור 2E. תקן את סרט ההדבקה הדו-צדדי בעובי 32 מיקרומטר למשטח חיתוך הדבק באמצעות סרט הדבקה והנח את משטח החיתוך במכונת החיתוך האוטומטית. חתכו את עיצוב התא מתוך סרט הדבק, תוך שימת לב לחיתוך הקצוות הארוכים של התא באותו כיוון לניתוק קל יותר בשלב 1.3. אחסנו את מגזרות הסרט בטמפרטורת החדר לאחסון לטווח ארוך. לאחסון לטווח קצר, אחסנו אותם בטמפרטורה של -20°C והסירו אותם רק זמן קצר לפני שלב 1.3. לטיפול קל יותר. קדח שני חורים בקוטר של כ-1 מ”מ באמצע מגלשת מיקרוסקופ סטנדרטית אחת (76 מ”מ x 26 מ”מ x 1 מ”מ), כאשר המרחק בין שני החורים הוא כ-3.5 ס”מ. ניקוי והפעלת פלזמה של מגלשות זכוכיתנקו מגלשת זכוכית אחת עם חורים ואחת ללא חורים באמצעות סבון. יש לשטוף היטב במים מזוקקים ולייבש באמצעות מגבונים מדויקים ללא סיבים. הניחו את מגלשות הזכוכית בחומר ניקוי פלזמה וטפלו בפלזמה במשטחים העליונים בהספק של 55 ואט למשך 10 דקות. הסר את שקופיות הזכוכית והמשך לשלב 1.3. הרכבה קאמריתהניחו את מגלשת הזכוכית עם חורים על משטח נקי כאשר הצד המופעל על ידי פלזמה פונה כלפי מעלה, מבלי לגעת במשטח המופעל. הסר את שכבת המגן מצד אחד של סרט ההדבקה הדו-צדדי, באותו כיוון חיתוך. מבלי לגעת, יישרו את מגרעת הסרט עם שולי מגלשת הזכוכית והחורים שנקדחו, והניחו את הסרט במגע איטי עם מגלשת הזכוכית החל מהקצה הקצר.הערה: שימו לב לא ליצור מתיחות או קפלים בסרט מכיוון שהדבר יגרום לגובה תא שגוי. מכיוון ששלב זה מועד לטעויות ודורש ניסיון מעשי, רצוי להכין מספר שקופיות זכוכית במקביל. הסר את שכבת ההגנה השנייה מהקלטת, שוב בכיוון החיתוך, והנח את מגלשת הזכוכית השנייה ללא חורים כאשר המשטח המופעל פונה כלפי מטה. לחץ על כל המשטח של שתי מגלשות הזכוכית יחד על ידי הנחת לוח שטוח למעלה ולחץ כלפי מטה בחוזק פלג הגוף העליון במשך כ -10 שניות. לאחר הרכבת שתי מגלשות הזכוכית, הפכו את התא כך ששני החורים פונים אליכם. הדביקו את הננו-יציאות לשני החורים על ידי הכנסת כמות קטנה של דבק הניתן לריפוי UV בטבעת מתחת ליציאה והנחת היציאה על גבי החור במגלשת הזכוכית. הוסף טבעת של דבק UV לריפוי סביב היציאה לרפא את הדבק עם מנורת UV. החדר אמור להיראות כעת כפי שמתואר באיור 2E. המשך מיד לשלב 1.4.הערה: אור UV עלול להזיק לעיניים ולעור. יש ללבוש ציוד מגן מתאים. ציפוי פלואורופילי של פני התאהערה: שלב זה צריך להתבצע תוך שעה לאחר טיפול פלזמה במגלשות הזכוכית (שלב 1.2.2) כדי להבטיח יעילות ציפוי טובה.מכינים טרי 1 מ”ל של תמיסת פלואורוסילן 1% (1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane) בשמן מופלר (HFE-7500) וממלאים אותו במזרק. דחפו את תמיסת הציפוי דרך מסנן מזרק PTFE ומחט בגודל 27G x 0.75 אינץ’ המחוברת למיקרו-צינורות PTFE בגודל 0.3 מ”מ x 0.76 מ”מ, לתוך תא התצפית. לאחר דגירה של דקה, יש לשטוף את תמיסת הציפוי אל מחוץ לתא באמצעות לחץ חנקן מתחת למכסה אדים. יש לשטוף את התא בשמן מופלר (HFE-7500 בלבד) באמצעות מכלול מזרק אחר. אחסנו את התא המלא בשמן מופלר עם פתחים סגורים בטמפרטורת החדר (RT). לאחר כל ניסוי, שטפו תאים וטיפות ישירות כדי להבטיח שימור טוב של הציפוי.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וניתן לאחסן את התאים ולעשות בהם שימוש חוזר למשך מספר חודשים. מחזיק תא עם מגנטיםליישור הננו-חלקיקים המגנטיים, יש להפעיל שדה מגנטי סטטי על תא התצפית במהלך אנקפסולציה והדמיה של טיפות. לשם כך, הניחו את התא במחזיק מיקרוסקופיה מותאם אישית המודפס בתלת-ממד (ראו איור 2D, והקובץ שנמצא ב-Bounab et al.17 Supplementary Data 4) שמחזיק שני מגנטים ניאודימיום לאורך הצדדים הארוכים של התא. 2. פונקציונליזציה של ננו-חלקיקים הערה: תהליך התפקוד של ננו-חלקיקים דומה עבור כל ציטוקין, ההבדל היחיד הוא הוספת נוגדנים ספציפיים ללכידה של ציטוקינים. התפקוד של כל ציטוקין מתבצע בצינורות תגובה שונים, נפרדים במקביל. לפני פרוטוקול זה, נוגדן לכידת TNFα ונוגדן זיהוי IL-1β סומנו בחברה עם ביוטין ו-Alexa Fluor 647, בהתאמה. הצמידות בוצעה על פי פרוטוקול היצרן שנמצא באתר האינטרנט של הספק (ראה קישורים בטבלת חומרים) והנוגדנים הועלו ואוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הוסף 50 μL של ננו-חלקיקים פונקציונליים סטרפטווידין (קוטר (Ø) 300 ננומטר) לתוך הצינור המיועד לגילוי TNFα, 50 μL עבור IL-1β, ו 100 μL עבור IL-6. דלל את תמיסת הננו-חלקיקים 1:1 (v/v) במי מלח חוצצי פוספט (PBS). יש להוסיף לכל צינור 1/20 (v/v) מהנפח המתאים של נוגדני לכידת הביוטינילציה (ריכוזי מלאי של 0.5 מ”ג/מ”ל) ולדגור במשך 30 דקות ב-RT.הערה: בעת הוספת נפחים קטנים לתמיסת הננו-חלקיקים, הפקד את הנפח בחלק העליון של הצינור ושטוף אותו מספר פעמים עם רוב התמיסה. זה מבטיח ערבוב נכון ומונע היווצרות של אגרגטים. הוסף 1/100 (v/v) של תמיסת D-ביוטין 1 mM לצינור ודגור במשך 5 דקות ב- RT. התוצאה היא ריכוז ביוטין סופי של 10 מיקרומטר.הערה: עודף ביוטין חוסם דפנות קשירה חופשיות על הננו-חלקיקים ומפחית היווצרות אגרגטים לא רצויים. אספו את החלקיקים על ידי החזקת מגנט ניאודימיום קרוב לצינור. חכו עד שהסופרנאטנט יהיה ברור והשליכו את הסופרנאטנט.הערה: המגנטים המשמשים לאורך הבדיקה מפגינים כוחות משיכה חזקים מאוד, אשר יכולים לגרום נזק פיזי אם שני מגנטים נצמדים זה לזה בטעות. כדי להפחית ספיחה לא ספציפית למשטח הננו-חלקיקי, השהה מחדש מיד את הננו-חלקיקים פי 0.5 מהנפח הסופי של שלב 2.1 של F-127 פלורוני (10%) ופי 0.5 מהנפח PBS. דגרו על הפתרון למשך 30 דקות ב-RT. אספו את החלקיקים באמצעות המגנט, השליכו את הסופר-נטנט והשהו מחדש בנפח גדול פי 1 ממאגר האחסון (RPMI 1640, החלפת סרום נוקאאוט 5%, 1% עט/סטרפ, 1% אלבומין בסרום אנושי רקומביננטי (HSA), 25 mM HEPES, 0.1% פלורוני F-127). דגרו על הפתרון למשך 30 דקות ב-RT.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וכעת ניתן לאחסן את החלקיקים למשך עד שבוע אחד ב- 4 °C. מיד לפני הכימוס, יש להשהות מחדש את החלקיקים על ידי צנרת ולערבב את הננו-חלקיקים המצומדים ביחס של 2:1:1 (v/v) עבור IL-6:TNFα:IL-1β, בהתאמה.הערה: היחסים השונים של ננו-חלקיקים פונקציונליים תלויים בזוג הנוגדנים המשמש עבור כל ציטוקין ונקבעו באופן ניסיוני באמצעות דגימות כיול כדי להשיג טווח דינמי אופטימלי. יש לשטוף עם מדיה מלאה (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 25 mM HEPES) על ידי איסוף החלקיקים עם המגנט, השלכת הסופרנאטנט והשעיה מחדש. חזור על שלב זה, אך השהה מחדש רק בעוצמת קול של פי 0.5 מעוצמת המדיה המלאה משלב 2.7. הוסף את נוגדני הזיהוי IL-6, TNFα ו- IL-1β המסומנים באופן שונה לתמיסה כדי להגיע לריכוז סופי של 10 ננומטר כל אחד. הפתרון מוכן כעת לשימוש בניסויי הטיפות. 3. הכנת תאים הערה: PBMC בודדו ממעיל באפי שהתקבל מבנק הדם של ציריך. התאים הוקפאו ואוחסנו בקריביאלים (1 x 10,7 תאים/בקבוקון) בחנקן נוזלי במשך מספר חודשים. הפשרת תאיםבשעה 1 לפני תחילת הניסוי, השאר את מאגר המדיה וה- MACS המלא (2 mM EDTA, 0.5% BSA ב- DPBS, מסונן סטרילי) כדי להתחמם ב- RT. הכן את הצינור המכיל את התאים על ידי הוספת 9 מ”ל של מדיה שלמה לתוך צינור 15 מ”ל ולשמור אותו באמבט המים ב 37 ° C. אחזר קריוביאל PBMC (המכיל ~ 1 x 107 תאים) מהאחסון שלו בחנקן נוזלי. מערבלים את צינור ההקפאה באמבט המים ב -37 מעלות צלזיוס עד שנשארת רק כמות קטנה של קרח. נגבו את הצינור עם 70% EtOH והעבירו אותו לארון הזרימה הלמינרית. הוסף 1 מ”ל של מדיה שלמה שחוממה מראש לקריוביאלי, ערבב בעדינות והעבר את כל התאים לתוך הצינור המכיל מדיה מלאה חמה. ניתן לשטוף את ה- cryovial עם 1 מ”ל של מדיה מלאה חמה כדי לשחזר את המספר המרבי של תאים. סובב את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT, להשליך את supernatant ו resuspend בעדינות עם פיפטה גלולת התא עם 1 מ”ל של מדיה שלמה. הוסף 9 מ”ל של מדיה מלאה. סובב את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant ו resuspend כמו קודם לתוך 1 מ”ל של מדיה מלאה. ספור את התאים באמצעות מונה התאים הזמין. במקרה זה, נעשה שימוש במונה תאים אוטומטי. התאים נספרו על ידי ערבוב 10 μL של תרחיף תאים עם 10 μL של כחול טריפאן והעברת 10 μL של התערובת לתוך שקופית ספירת התא. צביעה וחסימת FcRחשב את המספר הכולל של תאים ואת הנפח הדרוש כדי להשעות מחדש את התאים ב 2 x 106 תאים חיים / מ”ל. הכינו את תמיסת צביעת התאים (CellTrace Violet) על ידי דילול הציר (5mM) 1000x ב-PBS (ריכוז עבודה של 5 מיקרומטר). סובב את התאים ב- 500 x גרם למשך 5 דקות ב- RT. השליך את הסופרנאטנט והשהה מחדש את התאים בנפח המחושב של תמיסת צביעת התאים שהוכנה בשלב 3.2.1. לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 5 דקות. בסוף הדגירה, להרוות את הצבע שנותר בתמיסה על ידי הוספת מדיה שלמה (לפחות פי 2 נפח של תמיסת צבע). סובב את התאים ב- 500 x גרם למשך 5 דקות ב- RT. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את גלולת התא ל-60 מיקרוליטר של מאגר MACS והוסיפו 20 מיקרוליטר של בלוק FcR אנושי לכל 1 x 107 תאים. לדגור על התאים במשך 10 דקות ב- RT. מלא את הצינור עד 10 מ”ל עם מאגר MACS וסובב את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב- RT. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-1 מ”ל של מדיה שלמה ספרו את התאים כמתואר בשלב 3.1.6. גירוי תאים עם LPSבאמצעות ספירת התאים, לדלל את התאים ב 1 x 106 תאים / מ”ל ולהעביר 2 מ”ל של תאים לתוך כל באר בצלחת קישור נמוך במיוחד 6 באר. לדלל LPS במדיה שלמה ולהוסיף אותו לתוך הבאר המכילה את התאים עבור ריכוז סופי של LPS של 1 מיקרוגרם / מ”ל. לדגור על התאים במשך 6 שעות ב 37 ° C. הכנה לאנקפסולציהבסוף זמן הגירוי, להעביר את תרחיף התא לתוך צינור חדש 15 מ”ל. הוסף 1 מ”ל של מדיה שלמה לתוך הבאר הריקה. בעזרת מגרד תאים, נתקו את התאים הנותרים. העבר את התאים לתוך צינור חדש 15 מ”ל. לשטוף את הבאר עם 1 מ”ל של מדיה מלאה ולהעביר עוד 15 מ”ל צינור. סובב את שני הצינורות במהירות של 500 x גרם למשך 5 דקות ב- RT והעבר 1 מ”ל של תמיסת הסופרנאטנט הלא מדוללת (מהצינור הראשון המכיל את התאים שלא נשטפו) לצינור חדש לניתוח נוסף במידת הצורך (למשל, ELISA). השליכו את שאר הסופרנאטנטים. להשעות את הכדורים ב 0.5 מ”ל של מדיה מלאה, לשלב את התאים מאותה באר, ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגה. ספור את התאים כמתואר בשלב 3.1.6. סובבו את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT והשליכו את רוב supernatant (משאיר בערך 100 μL). מבלי להשעות מחדש את הכדור, להוסיף בזהירות רבה 200 μL של מדיה מלאה. השליכו את הסופרנטנט. השהה מחדש את התאים במדיה מלאה בריכוז של 6.6 עד 13.3 x 106 תאים/מ”ל כדי להשיג מספר תאים ממוצע לטיפה של λ = 0.2-0.4 עבור אנקפסולציה, כפי שמוגדר בשלב 8.6.הערה: שלבים 3.4.6 ו-3.4.7 צריכים להתבצע מיד לפני האנקפסולציה כדי למנוע הפרשת ציטוקינים לסופרנטנט. מספר התאים לטיפה עוקב אחר התפלגות פואסון: , כאשר P מראה את שבר הטיפות המכילות X תאים ו- λ הוא מספר התאים הממוצע לטיפה. 4. אנקפסולציה וייצור טיפות הערה: האנקפסולציה של תאים בטיפות מתאפשרת על ידי שבב מחולל טיפות מיקרופלואיד, שעבורו הייצור מתואר בפירוט רב במקום אחר17. חלופות זמינות מסחרית (ראה דוגמה בטבלת חומרים). תכנון מתאים של שבב מחולל טיפות כולל שני פתחים לפאזות מימיות, כניסה אחת לשלב השמן ושקע אחד לטיפות שנוצרו. יתר על כן, שבב מחולל טיפות מסחרי מתאים אמור לאפשר הפקת מים בטיפות שמן מופלרות בנפח 40-60 pL. הפרוטוקול המתואר כאן יוצר תחליב מים/שמן (טיפות) בקוטר של 50 מיקרומטר. שימוש באפשרויות שונות לשינוי הפרוטוקול יכול לגרום לטיפות גדולות או קטנות יותר. הכנת משאבת המזרק (איור 2A)מלא מזרק 1 מ”ל עם 500 μL של שלב רציף המורכב 2% 008-Fluorosurfactant בשמן HFE-7500 פלואור. חבר מחט בגודל 27G x 0.75 אינץ ‘למיקרו-צינורות PTFE בגודל 0.30 מ”מ x 0.76 מ”מ והרכיב את המכלול על המזרק ולאחר מכן על משאבת המזרק.הערה: ודא שלא נשאר אוויר במזרק או בצינורית מכיוון שהדבר מונע קצבי זרימה עקביים. הכינו שני מחברי קצה פיפטה בהתאמה אישית עבור השלבים המימיים (איור 2B): נקבו חור עם ניקוב ביופסיה של Ø0.75 מ”מ באמצע מגרעת PDMS בגובה ~5 מ”מ עם Ø6 מ”מ. משוך ~ 3 ס”מ של צינורות PTFE (קוטר פנימי 0.56 מ”מ, קוטר חיצוני 1.07 מ”מ) דרך החור במגרעת PDMS ודחוף את המכלול לחלק העליון של קצה פיפטה 200 μL. חבר את הצד השני של הצינור למחט 23Gx 1.25 אינץ ‘. אטמו את המחבר על ידי פיזור דבק הניתן לריפוי UV על גבי פיפטה ורפא אותו באור UV.הערה: מכיוון שאור UV מזיק לעין, הרכיבו משקפי מגן חוסמי UV להגנה. מלאו שני מזרקים של 1 מ”ל ב-500 מיקרוליטר שמן מינרלי קל, חברו שתי מחטים של 23 גרם עם האביזרים המותאמים אישית והרכיבו את שניהם על משאבת המזרק. שאפו 30 μL של ננו-חלקיקים ו-30 μL של תמיסת תאים לתוך קצות הפיפטה של השלבים המימיים באמצעות תוכנת הבקרה של משאבת המזרק. הכינו תא תצפית על ידי ניקוי המשטח במים כדי להסיר לכלוך ואבק וייבשו אותו במגבונים מדויקים. הדקו את התא למחזיק התא המודפס המצויד בשני מגנטים ניאודימיום.הערה: ודא שהמגנטים מצביעים בכיוון הנכון (מושכים זה את זה) כדי ליצור צבר מוארך. זווית קלה של התא (30°). פתח את שתי היציאות וחבר מגבת נייר ליציאה העליונה כדי לספוג את השלב החיצוני העודף במהלך המילוי. ייצור טיפות ומילוי קאמריחברו את הפאזה הרציפה באמצעות צינורות לכניסה העליונה של השבב המיקרופלואידי (איור 2A,C,F). שטפו את השבב למשך כ-30 שניות בפאזה רציפה בקצב זרימה של 1800 מיקרוליטר/שעה. חברו את קצות הפיפטה של התמיסות המימיות לשני הפתחים האמצעיים (איור 2A,C,F). התחל את זרימת התמיסה המימית עם 200 μL / h כל אחד ולתת את התעלות ואת היציאה להיות מלא בנוזל. בעת שימוש בננו-חלקיקים מגנטיים, תמיסה הומוגנית, בצבע חום-אדום צריכה לזרום החוצה ממוצא השבב. ברגע שהנוזל מופיע בשקע, התחל את זרימת שלב השמן המופלר ב 800 μL / h והמתן עד לייצור טיפות יציב, מאושר על ידי זרימת תמיסה הומוגנית, אפורה ומבריקה בשקע. לאחר שנוצרה ייצור יציב של טיפות, אספו את הטיפות המיוצרות על-ידי חיבור מיקרו-צינורות PTFE (קוטר פנימי של 0.3 מ”מ x קוטר חיצוני של 0.76 מ”מ) ליציאת היציאה וכוונו אותן לתוך תא תצפית על-ידי העברת המיקרו-צינורות דרך מודול הפרול של מתקן מקשה אחת אטום לאצבע (איור 2A). אם מתרחש ייצור טיפתי תקין, נוזל הומוגני ומבריק צריך למלא את החדר בחזית ישרה מלמטה למעלה. לאחר מילוי התא, עצור את הזרימה וסגור את היציאות באמצעות תקעי יציאות באמצעות לחץ חזק באצבע.הערה: שימו לב לא לסגור את החדר חזק מדי. לכידה או זרימה של אוויר יכולה להוביל לתנועות של הטיפות ובכך לפגוע במעקב במהלך המדידה. לאחר ייצור טיפתי, לשטוף את השבב עם שמן מופלר ולפוצץ כל תזכורת של נוזל עם חנקן כדי לשמור על תפקודו. ניתן לעשות שימוש חוזר בשבבים מספר פעמים ולאחסן אותם במשך חודשים כל עוד הם אינם סתומים. איור 2: סקירה כללית של המבנה המיקרופלואידי. (A) התקנה לעטיפת טיפות באמצעות משאבת המזרק, שבב יצירת הטיפות ותא התצפית ומחזיק המיקרוסקופ. (B) תמונה של תקע PDMS מנוקב (למעלה) ליצירת מחבר לקצה פיפטה של 200 μL (למטה), כמתואר בשלב 4.1.2 של הפרוטוקול. (C) תמונות של חיבור קצות פיפטה לשבב יצירת טיפות. (D) תמונה של התא המוצב בתוך מחזיק מיקרוסקופ מותאם אישית המודפס בתלת-ממד עם שני מגנטים למעלה ולמטה. (E) תצלום של חדר תצפית (עם סרט לבן להמחשה). (F) פריסת השבב המיקרופלואידי ליצירת טיפות (סרגל קנה מידה: 750 מיקרומטר). נתון זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 5. רכישה ומדידה של תמונות הערה: רכישת התמונה מתבצעת במיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי הפוך סטנדרטי המוקף באינקובטור, ומאפשר מדידות ב-37°C. ההגדרות המתוארות כאן הן ספציפיות עבור מיקרוסקופ Nikon Eclipse Ti2 הפועל עם תוכנת NIS Elements (V. 5.30.04) המצוידת במצלמת Orca Fusion, אך בדרך כלל ניתנת להתאמה לכל מיקרוסקופים ומצלמות פלואורסצנטיות אחרות. הגדרת פרמטרי מדידהכדי להגדיר את גודל התמונה, בחר גודל מערך של 10 x 10 תמונות. מערך זה יכיל בין 50,000 ל-70,000 טיפות. השתמשו בחפיפה של 1% והפעילו מיזוג לתפירת תמונה. כדי להגדיר את מספר הערוצים הנמדדים, בחר בערוץ DAPI לזיהוי תאים, FITC, TRITC, Cy5 ערוצים לזיהוי ציטוקינים (חרוזים) וערוץ BF לזיהוי טיפות. השתמש בשילוב פיקסלים של 2 x 2 ו- 16 סיביות לעומק סיביות. התאם את הגדרות המצלמה כדי להשיג ערכי פיקסלים בעוצמה של טיפה שאינם מגיעים למקסימום של המצלמה עבור כל ערוץ פלואורסצנטי.הערה: זמני החשיפה המדויקים ועוצמות המנורה עבור כל ערוץ תלויים בדגם ובריאגנטים המשומשים ונקבעים לפני יצירת עקומות כיול (שלב 7). שימוש באותן הגדרות רכישה בכיול ובמדידות תאים חשוב לכימות מדויק. להגדרת המדידה שנפתרה בזמן, בחרו מדידה כל 30 דקות ל-9 מדידות בסך הכל.הערה: פרמטרי המדידה עשויים להיות שונים עבור תאים משומשים, ממריצים, ריאגנטים, ציטוקינים שנמדדו, טמפרטורת הדגירה ומודלים של מיקרוסקופ. התחלת המדידההרכיבו את מחזיק התא על המיקרוסקופ עם שלב בפורמט צלחת היטב (איור 2D) ועברו לערוץ שדה בהיר (BF) באמצעות המטרה 10x. התמקדו בטיפות המשותקות ב-BF וודאו שהמכלול מורכב במישור מושלם על ידי סיבוב והתאמה במידת הצורך. עבור למרכז החדר עבור השלבים הבאים. הפעל את מערכת המיקוד האוטומטית (PFS) והגדר אותה למישור המדידה האופטימלי בערוץ BF כך שקצוות הטיפות יופיעו כעיגולים שחורים וחדים שניתן להבחין ביניהם בקלות מפאזת השמן והרקע.הערה: מדידות אפשריות גם ללא מערכת מיקוד אוטומטית, אך אם המיקרוסקופ מצויד במערכת כזו, אנו ממליצים בחום להשתמש בה. הדבר משפר את איכות המדידה של תמונות גדולות ותפורות בכבדות. עברו על כל ערוצי הפלואורסצנטיות והגדירו את מישור המדידה האופטימלי לכל אחת מהן. למדידות רילוקיישן בתעלות FITC, TRITC ו-Cy5, ודא שצבר הננו-חלקיקים נמצא בפוקוס מושלם, עבור ערוץ DAPI, ודא שהתאים נמצאים במיקוד.הערה: מישורי מוקד וערכי z מיטביים עשויים להיות שונים עבור כל הערוצים הנמדדים. הקפד לשמור היסט PFS בודד עבור כל ערוץ. לפני תחילת המדידה, עברו על כל הערוצים כדי לבדוק שוב את המוקדים הבודדים והמתינו 5 דקות לאיזון מכיוון שהתנועה עשויה להתרחש בתחילה בזמן שהתמיסות מתחממות. התחל את המדידה. לאחר יצירת התמונה הראשונה, בדוק אם יש חריגות (מיקוד, טיפות נעות, ערוצים שגויים וכו ‘). הפעל מחדש את הרכישה במידת הצורך, או במקרה של אוויר, מלא מחדש את החדר (התחל משלב 4.1.4). השאירו את המכלול כדי לצלם את הטיפות במשך 4 שעות. 6. ניתוח תמונות התקן תוכנה לניתוח תמונות (DropMap Analyzer App v 4.023) ב- MatLab (https://github.com/ESPCI-LCMD/MiMB) והעבר את קובץ ה- .nd2 שנוצר מהניסוי למחשב ניתוח. פתח את היישום. בחר את ההגדרות שצוינו, אחרת השאר את ערך ברירת המחדל: CH1: DAPI, WD (טיפה שלמה) מסומן; CH2: FITC, BL (קו חרוזים) נבחר; CH3: TRITC, BL נבחר; CH4: Cy5, BL נבחר; קוטר טיפה מרבי (מיקרומטר): 70; זיהוי נפילה: מלא; מעקב: כן. לחץ על לחצן התחל (סמל פירות) כדי לבחור את מיקום הקובץ .nd2 ולהתחיל בניתוח. לאחר מספר דקות, התוכנית תציג קטע לדוגמה של התמונה (איור 3A). לחץ על רווח עד שתמצא פריט מתאים לזיהוי טיפות ולאחר מכן הקש Enter. באותו מקטע תמונה, ציירו מלבן באזור מייצג למציאת פרמטרי סף לזיהוי טיפות. לאחר מספר דקות, ייפתח חלון נוסף המציג את התפלגות העוצמה של ערוץ DAPI. גרור ושחרר את המחוון כדי לזהות רק את האות מהתאים המוכתמים ולחץ על סיום בפינה השמאלית העליונה. לאחר חלוקת התמונה לטיפות בודדות בקטרים קטנים מקוטר הטיפה המרבי (μm), התוכנית תבצע כעת את השלבים הבאים עבור כל טיפה, נקודת זמן וערוץ פלואורסצנטי ללא קלט נוסף של המשתמש (ראה איור 3).התוכנה מחשבת את הפיקסלים המועברים של הטיפה בין נקודות זמן (טיפות הנעות יותר מ -40 פיקסלים אינן נכללות באופן אוטומטי). התוכנה מודדת את הערך הפלואורסצנטי הממוצע של הטיפה כולה, מזהה ומודדת את עוצמת קו החרוזים הממוצעת על ידי מציאת הפיקסל הבהיר ביותר בקו אופקי וממוצע כל עוצמות הפיקסלים בקו אנכי מלמעלה למטה של הטיפה. זה נעשה באופן אוטומטי ומשמש לחישוב ערכי מיקום חרוזים ממוצעים (איור 3B) בהתאם למשוואה: התוכנה מחשבת את אחוז הפיקסלים הכולל באזור הטיפה מעל הסף שנקבע בערוץ DAPI. קובץ ה- .xslx המתקבל יכיל את העמודות המעניינות הבאות לניתוח נוסף: DropIdX (מזהה הטיפה במעקב לאורך זמן), TrueCentroid_ t*2-1 ו- t+2 (קואורדינטות x ו- y, בהתאמה, של מרכז הטיפה עבור נקודת זמן t), DiameterMicrons (קוטר הטיפה במיקרומטר), TrackingMove (מספר הפיקסלים שהועברו לאורך כל זמן המדידה), FluoChannel_BL_Ratio_t (ערך מיקום מחדש עבור FluoChannel בנקודת זמן t), DAPI_WD_PosPxlCount_t (מספר הפיקסלים מעל הסף בכל הטיפה בערוץ DAPI בנקודת זמן t). איור 3: ניתוח תמונות המבוצע על-ידי תוכנת ניתוח התמונות. (A) טיפות מזוהות בערוץ שדה בהיר (BF) באמצעות טרנספורמציית Hough, המסמנת כל טיפה בעיגול אדום. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. (B) בתוך כל טיפה, קו החרוזים של ננו-חלקיקים מזוהה דרך הפיקסלים הבהירים ביותר במישור האופקי ועוצמות הפלואורסצנטיות הממוצעות עבור כל הפיקסלים המשתרעים מלמעלה למטה של הטיפה. בנוסף, התא מזוהה באמצעות אחוז פיקסלים >0 מעל הסף עבור כל אזור הטיפה. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (C) תוכנת המנתח משווה את עוצמת הפלואורסצנטיות של הננו-חלקיקים לרקע הטיפות של תעלות FITC, TRITC ו-Cy5 בכל נקודות הזמן הנמדדות עבור כל טיפה בודדת. מוצגות נקודות זמן 0, 4 (120 דקות) ו- 9 (240 דקות). כדי לבדוק באופן ידני אם יש זיהוי נכון של טיפות ותאים, ערוצי DAPI ו- BF מוצגים גם כן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 7. כיול הערה: לצורך קריאה כמותית, יש לבצע את הכיול של ריכוזי ציטוקינים לערכי רילוקיישן פלואורסצנטי פעם אחת, מכיוון שיכולים להתרחש הבדלים בין מערכי ניסוי שונים. כל השלבים הנדרשים מפורטים בסעיפי הפרוטוקול הקודמים כפי שהוזכרו. הכינו ננו-חלקיקים כמתואר בשלב 2. להרכיב מחדש את החלבונים הרקומביננטיים IL-6, TNFα ו- IL-1β האנושיים בהתאם להוראות היצרן.הערה: יש לוודא שהאליציטוטים הקפואים מופשרים פעם אחת בלבד ומשתמשים בהם מיד. הכינו סדרת דילול כפול 2 עבור כל שלושת החלבונים יחד באמצעות מדיה מלאה (10% FBS, 1% Pen/Strep, 25 mM HEPES) עם ריכוז התחלתי של 80 ננומטר עד 0.625 ננומטר. בצע את האנקפסולציה כמתואר בשלב 4 עם ננו-חלקיקים פונקציונליים בשלב הראשון ו-RPMI רק בשלב המימי השני. מדידה זו משמשת כריק וסטיית התקן הנמדדת משמשת לניתוח נתונים בהמשך. המתן 5 דקות וצלם את הטיפות כמתואר בשלב 5. צלם 3 תמונות בגודל מערך של 2 x 2 בתעלות הפלואורסצנטיות המתאימות. חזור על שלבים 7.4 ו- 7.5 עם כל פתרונות הכיול המוכנים, החל מהנמוך ביותר וכלה בריכוז הגבוה ביותר. נתח את התמונות כמתואר בשלב 6. אל תשתמש באפשרות WD עבור ערוץ DAPI והגדר את מעקב ללא. הניתוח מפיק ערכי רילוקיישן פלואורסצנטיים עבור כל טיפה שנמדדה בתמונה אחת. חלץ את החציון וסטיית התקן עבור כל תעלה פלואורסצנטית. ממוצע החציון וסטיית התקן עבור כל תמונה שנמדדה לכל ריכוז. צור עקומת כיול על ידי התוויית המעבר החציוני הממוצע כנגד הריכוזים הנמדדים של כל חלבון רקומביננטי. התאם את העקומות באמצעות שיוך חד-פאזי: ,עם Y = מיקום מחדש ב- x, Y0 = מיקום מחדש של מדידה ריקה ו- x הריכוז המשומש. עקומת הכיול המתקבלת משמשת לכימות ערכי רילוקיישן כמתואר בשלב 8.הערה: התאם רק ערכים עד לרילוקיישן הנמדד הגבוה ביותר ולא לכלול ערכים בריכוזים גבוהים יותר עם רילוקיישן נמדד נמוך יותר. ירידה בערכי הרילוקיישן הנמדדים בריכוזים גבוהים יותר צפויה ומתרחשת עקב אפקט הוק ויכולת הקישור המוגבלת של הננו-חלקיקים. 8. ניתוח נתונים אל תכלול טיפות עם ערך TrackingMove גבוה מ- 10, כלומר שזזו יותר מ- 10 פיקסלים במהלך הזמן של המדידה. זהה טיפות המכילות תאים מוכתמים (ערוץ DAPI) בנקודת הזמן הראשונה על-ידי מיון טיפות שערכן גבוה מ- 0 בעמודה DAPI_WD_PosPxlPercent_1. זהה טיפות המכילות תאים מפרישים על ידי החלת 3 הקריטריונים הבאים על מיקום מחדש פלואורסצנטי של כל תעלה פלואורסצנטית (עמודות FluoChannel_BL_Ratio_t).זיהוי טיפות עם ערכי רילוקיישן הולכים וגדלים, על ידי מיון שיפוע חיובי לאורך זמן מדידה. זיהוי טיפות עם ערכי רילוקיישן המגיעים לגבול הזיהוי (LOD). טיפה נבחרת כאשר מיקום הפלואורסצנטיות המרבי לאורך זמן המדידה עדיף על LOD, המחושב כמתואר במקום אחר25: , כאשר μרילוקיישן t0 הוא החציון של כל ערכי הרילוקיישן בנקודת זמן 0 ו- σ BLK סטיית התקן של הריק שנמדדה במהלך הכיול, כל אחד מהם ספציפי לציטוקינים. לוודא שהעלייה בערך הרילוקיישן משמעותית על ידי בדיקה שהשינוי בין מיקום פלואורסצנטי מקסימלי למינימום שנמדד לאורך זמן המדידה עדיף על: . זהה תאים מפרישים במשותף על-ידי עמידה בקריטריונים המתוארים בשלב 8.3. עבור יותר מערוץ פלואורסצנטי אחד בו-זמנית. חזור על שלב 8.3. עבור כל הטיפות שאינן מכילות תא (DAPI_WD_PosPxlPercent_1 = 0). השתמש בטיפות אלה כדי לחשב את אחוז החיובי הכוזב. קבע את ערך λ המדויק של המדידה על ידי בחירה אקראית של 200 – 500 טיפות ובדיקתן באמצעות פונקציית אימות ומיון של תוכנת ניתוח התמונות. ספרו את מספר התאים בטיפות אלה וחשבו את:λ = מספר התאים שנספרו / מספר הטיפות שנותחו חשב את המספר הכולל של תאים עטופים למדידה לפי:ספירת תאים כוללת = λ × מספר הטיפות שנותחו חשב את אחוז התאים המפרישים באמצעות ספירת התאים שנקבעה. בנוסף, חשבו את אחוז החיוביים הכוזבים עבור כל ציטוקין (בדרך כלל פחות מ-3%-5% ביחס למספר החיוביים האמיתיים לערוץ) והשתמשו בהם כבקרה פנימית לעקביות ניסוי ויכולת שחזור. כדי לחשב ריכוזי ציטוקינים מופרשים, המירו ערכי רילוקיישן לריכוז באמצעות משוואות הכיול שנקבעו משלב 7.10. חשב קצב הפרשה (SR) בין נקודות זמן באמצעות המשוואה הבאה. חישוב קצב ההפרשה הממוצע על פני המדידה על ידי ממוצע שיעורי ההפרשה הבודדים בין נקודות זמן. אם המיקום המרבי הניתן למדידה הושג לפני סוף המדידה, הגדר את הריכוז לריכוז המרבי הניתן למדידה (ערך זה הוא ספציפי לציטוקינים ומתאים לריכוז המרבי שנמדד ושימש בעקומת הכיול בשלב 6.10), ואל תחשב ריכוז נוסף. חישוב קצב ההפרשה והממוצע רק עד לנקודת זמן זו.הערה: אם פחות מ-50 תאים מפרישים מזוהים בתעלה פלואורסצנטית אחת, יש לבחון את הטיפות באופן חזותי באמצעות פונקציית אימות ומיון, וניתן להוציא מהניתוח טיפות בעלות צברים פלואורסצנטיים או ננו-חלקיקים. כדי לחלץ פרמטרים נוספים מעקומת ההפרשה של כל תא בודד, בצע התאמה ריבועית לפחות לעקומת ריכוז הזמן עבור כל תא וציטוקין באמצעות סקריפט Python מותאם אישית (זמין לפי בקשה). הפונקציה המותאמת היא עקומה סיגמואידלית בעקבות הנוסחה המתוארת להלן (מתאים עם R2<0.95 אינם נכללים בשלבים הבאים):כאשר C מתאים לרמת הריכוז [nM], t50 להסטת חצי המקסימום [s], ו-m למדרון הגבעה [min-1]. מפרמטרים אלה מופקים מתארי העקומה הבאים כמתואר להלן.Cmax [nM]: ריכוז מרבי שנמדד. זמן תחילת ההפרשה, כאשר ההתקף מגיע ל -10% צלזיוס.: שיעור הפרשה כשיפוע הליניארי המשוער של העקומה בין 10% ל-90% מעקומת ריכוז הזמן.:

Representative Results

פלטפורמת התא היחיד הפונקציונלית המוצגת אפשרה מדידה של מספר פרמטרים. ראשית, ובדומה לשיטות סטנדרטיות, תדירות הפרשת התאים מתוארת בסוף המדידה (איור 4A). לאחר גירוי עם 1 מיקרוגרם / מ”ל של lipopolysaccharide (LPS) במשך 6 שעות של תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם (PBMC), 5.81% מהתאים הפרישו IL-6 (n = 1270), 4.55% TNFα (n = 995) ו 6.06% IL-1β (n = 1326). כדי לכמת את הפרשת הציטוקינים, נוצרו עקומות כיול עם ריכוזים ידועים של ציטוקינים רקומביננטיים (איור 4B). עקומות כיול אלה מאפשרות לכמת את ריכוזי הציטוקינים בטיפות לאורך זמן. לדוגמה, הריכוז הממוצע בטיפות IL-6 הגיע לרמה לאחר 90 דקות עבור PBMC מגורה LPS, בעוד שהריכוז הממוצע בטיפות IL-1β גדל מהר יותר מ-90 דקות, מה שמציג את הרזולוציה הדינמית של הפלטפורמה ואת האפשרות לחלץ תת-אוכלוסיות תאים המפרישות ציטוקינים ספציפיים (איור 4C). מכיוון שהריכוז משתנה בין נקודות המדידה, ניתן לחשב את שיעורי ההפרשה הדינמיים לכל ציטוקין. בהתחשב בקצב ההפרשה הממוצע של כל ציטוקין (איור 4D), תאים מפרישי IL-6 הציגו ירידה מתמדת בקצב ההפרשה הממוצע, בעוד שתאים מפרישי TNFα ו-IL-1β הראו שניהם עלייה בקצב ההפרשה לאחר זמן מדידה של 90 דקות וירידה שנייה לאחר 150 דקות. יתר על כן, אפשר לקבץ תאים לתת-אוכלוסיות כתלות בציטוקינים המופרשים והמופרשים יחד (איור 4E). כאן, IL-6 ו-TNFα מופרשים באופן יחיד על ידי 30.2% ו-26.4% מהתאים המפרישים IL-6 או TNFα, בהתאמה, בעוד שתאי IL-1β המפרישים יחיד מהווים 68.8% מכלל התאים המפרישים IL-1β. נוסף על כך, ניתן לפתור את ההשפעות של הפרשה משותפת על ריכוזים מופרשים ועל שיעורי ההפרשה (איור 4F). על ידי התבוננות בתאים מפרישי IL-6, כמויות שונות של IL-6 הופרשו אם התאים ייצרו בנוסף TNFα או IL-1β. באופן דומה, התפלגות שיעורי ההפרשה הממוצעים על פני המדידה הייתה שונה סטטיסטית בין התאים המפרישים רק IL-6 או IL-6 לצד TNFα (שיעורי הפרשה גבוהים יותר) ו- IL-1β (שיעורי הפרשה נמוכים יותר של IL-6). איור 4: תוצאות מייצגות של IL-6, TNFα ו-IL-1β המפרישים PBMC לאחר גירוי של 6 שעות עם 1 מיקרוגרם/מ”ל LPS. (A) אחוז PBMC המפריש IL-6, TNFα ו-IL-1β בסוף המדידה של 4 שעות. (B) עקומות כיול ציטוקינים מרובות נוצרות עם ריכוזים ידועים של ציטוקינים רקומביננטיים. זה מאפשר לכמת ניסויים בתאים על ידי חישוב מערך הרילוקיישן את ריכוז הציטוקינים בתוך הטיפה. הנקודות הותקנו באמצעות התאמה לא ליניארית של עקומת אסוציאציה חד-פאזית, r2=0.9926 (IL-6), 0.9901 (TNFα), 0.9990 (IL-1β). (C) ריכוזים מופרשים ממוצעים של IL-6, TNFα ו-IL-1β המשתחררים על ידי הפרשת PBMC במשך 4 שעות מדידה. (D) שיעורי הפרשה ממוצעים של IL-6, TNFα ו-IL-1β במשך 4 שעות מדידה. (E) אחוז יחסי של תאים מפרישים משותפים המפרישים IL-6, TNFα או IL-1β ושילובים שלהם. מנורמל לכל התאים המפרישים שזוהו עבור כל ציטוקין. (F) ריכוזי IL-6 ממוצעים לאורך זמן המדידה והתפלגויות קצב הפרשה ממוצע (log) עבור תאים מפרישים IL-6 עם רזולוציית הפרשה משותפת (n=383 עבור IL-6 בלבד, n=531 עבור IL-6 + TNFα, n= 213 עבור IL-6 + IL-1β ו-n=143 עבור IL-6+TNFα+IL-1β). הבדלים סטטיסטיים בהתפלגות קצב ההפרשה הוערכו באמצעות מבחני קולמוגורוב-סמירנוב דו-צדדיים, לא מזווגים, לא פרמטריים בביטחון של 95%, ערך ה-p מיוצג. ** (p <0.002) ו- **** (p <0.0001). הקו המלא מייצג את החציון והקו המקווקו מייצג את הרביעונים. nסה”כ תאים = 21 866. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. כדי לחלץ מידע נוסף על רמת התא הבודד, ניתן להתאים פונקציית סיגמואיד לנקודות זמן הריכוז של כל תא וציטוקין (איור 5). ריכוז מופתי לאורך זמן עבור תא אחד וההתאמה הסיגמואידלית המתאימה מתוארים באיור 5A. כאן, הליך התאמת הריבועים הפחותים מניב את הפרמטרים הבאים: C, המתאים לערך הרמה העליונה של העקומה, t50 המכמת את הסטת העקומה בזמן מאפס, ומדרון הגבעה m, המתאר את התלילות של החלק העולה של העקומה הסיגמואידית עם ערכי ריכוז של 10% ו -90% שהושגו לאורך כל המדידה. מפרמטרי התאמה אלה, ניתן לחלץ כמה מתארי עקומה כפי שמוסבר בשלב 7.12. מניב את Cmax, ערך הריכוז הגבוה ביותר של הנתונים,t start, זמן תחילת ההפרשה, המוגדר כהגעה ל-10% מערך ריכוז הרמה העליונה, ו-SRlin, קצב ההפרשה במהלך החלק העולה של העקומה. כדי לסווג תת-אוכלוסיות תאים, תיאורי העקומה שהתקבלו מכל ההתאמות החד-תאיות סווגו לשלוש קטגוריות כל אחת: ערכי Cmax קובצו לנמוכים, בינוניים וגבוהים עבורt התחלה למוקדם, בינוני ומאוחרSR lin למפרישים איטיים, בינוניים ומהירים. כדי להמחיש סיווג זה, מוצגות ארבע עקומות הפרשה מופתיות של תא בודד ומתארי העקומה המתאימים להן (איור 5A-D), כאשר עקומה A מציגה את המאפיינים של מפריש נמוך מוקדם של קצב בינוני, עקומה B היא מפרישה מוקדמת, איטית וגבוהה, עקומה C היא מפרישה גבוהה מהירה מוקדמת, ועקומה D מציגה הפרשה נמוכה מאוחרת. חשוב לציין כי החתכים עבור קריטריונים אלה הם ספציפיים לתאים, ציטוקינים ופרמטרי בדיקה, ויש להתאים אותם לכל שאלת מחקר. יתר על כן, רק הפרשת IL-6 של PBMC לאחר גירוי LPS של 1 מיקרוגרם/מ”ל במשך 6 שעות נחשבה כאן, כלומר רוב התאים היו מפרישים מוקדמים וגבוהים עם 80% ו-79%, בהתאמה (איור 5E-F). לגבי קצב ההפרשה, נצפתה תגובה דו-קוטבית כאשר 55% מהתאים המפרישים IL-6 הם מפרישים איטיים ו-39% מפרישים מהר (איור 5G). כדי לאפיין עוד יותר את התנהגות ההפרשה, תוארי העקומה של כל תא שורטטו זה כנגד זה וחולצו צבירים שונים (איור 5H-J). לא ניתן מתאם ברור בין tstart ו-Cmax (איור 5H): שתי האוכלוסיות הגדולות ביותר היו מפרישים נמוכים מוקדמים ומפרישים גבוהים ללא תלות בהתחלת הפרשה. בהתחשב בקשר ביןt start ו-SRlin (איור 5I), רוב התאים היו מפרישים איטיים מוקדמים עם אוכלוסייה ברורה של מפרישים גבוהים מוקדמים ומעט מפרישים איטיים/בינוניים עד מאוחרים. באשר למתאמים בין SRlin ו-Cmax (איור 5J), כמעט ולא היו מפרישים מהירים נמוכים עד בינוניים, ורק אוכלוסייה גדולה יותר של מפרישים נמוכים במהירות. יתר על כן, הייתה אוכלוסייה גדולה של מפרישים מהירים שלא היו תלויים בריכוז המקסימלי שנמדד, ושתי אוכלוסיות של מפרישים גבוהים הפרישו לאט או מהר. לסיכום, ניתן להסיק כי חקירת הקשר בין מתארי העקומה עבור תאים בודדים מניבה ניתוח מפורט הרבה יותר ועשויה לחלץ ממצאים ביולוגיים חדשים ממדידות הפרשה של תא בודד. בעזרת הניתוח שהוצג לעיל, חילצנו את דינמיקת ההפרשה של תאים מפרישים במשותף (איור 6). שתי עקומות לדוגמה מראות דינמיקה שונה של הפרשה משותפת עבור IL-6 ו-TNFα משני תאים בודדים עם התחלה סימולטנית של שני הציטוקינים (איור 6A), או התחלת הפרשה רציפה, כאשר IL-6 מופרש ראשון (איור 6B). כדי לסווג את כל התאים המפרישים במשותף, הוגדר עיכוב הפרשה של 60 דקות, כאשר כל התאים המתחילים להפריש בטווח זה נחשבים למפרישים בו זמנית וכל התאים עם עיכובים ארוכים יותר נחשבים למפרישים רציפים. ניתוח זה גם איפשר את האפשרות לראות איזה ציטוקין הופרש ראשון. עבור IL-6 ו-TNFα, נצפתה בעיקר הפרשה משותפת סימולטנית ב-76% מהתאים (איור 6C), ואילו עבור IL-6 ו-IL-1β, הפרשה משותפת רציפה נצפתה ב-86% מהתאים, כאשר IL-6 היה הציטוקין הראשון שהופרש ברוב המקרים (איור 6D). בהסתכלות על זמן ההפרשה של הציטוקינים השונים עבור כל התאים המפרישים המשותפים הבודדים, לא נצפה מתאם ברור בין זמני התחלת ההפרשה בניסויים שבוצעו. עבור הפרשה משותפת של IL-6 ו-TNFα (איור 6E), היה צביר אנכי גדול יותר בסביבות 0 דקות, המתאים לתאים המפרישים יחד בשכיחות גבוהה יותר החל מ-IL-6. עבור הפרשה משותפת של IL-6 ו-IL-1β (איור 6F), רוב התאים החלו להפריש IL-6 סביב תחילת המדידה, בעוד ש-IL-1β הופרש בעיקר מאוחר יותר. לסיכום, הניתוח המוצג כאן איפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות מפרישים שונות ודינמיקה מורכבת של הפרשת ציטוקינים. איור 5: ניתוח מפורט של תבניות דינמיות שונות של הפרשה עבור עקומות תאים מפרישים בודדים מסוג IL-6. (A) נתוני ריכוז ציטוקינים מייצגים של תא בודד לאורך זמן המדידה עם עקומת הסיגמואיד המותאמת והפרמטרים שחולצו. (ב-ד) שלוש עקומות ריכוז ציטוקינים חד-תאיות לדוגמה עבור סוגי מפרישי הציטוקינים השונים שנמצאו עבור הפרשת IL-6 לאחר גירוי LPS. (ה-ג) אחוזים של תאים מפרישים IL-6 המסווגים לסוגי המפרישים השונים עם הקריטריונים הבאים (n=633): E. Cmax: נמוך 19.5 nM, F. tהתחלה: מוקדם 120 דקות, G. SRlin: איטי 750 מולקולות/שנייה. (H-J) הקשר בין שלושת תיאורי עקומת ההפרשה Cמקסימום, tstart ו-SRlin עבור כל תא בודד (n = 633). האוכלוסייה הגדולה ב- Cmax=20nM נובעת מהגעה לגבול הגילוי העליון של הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: חילוץ דפוסי הפרשה משותפת מעקומות ריכוז של תא בודד. (A-B) עקומות ריכוז מייצגות עבור תאים בודדים המפרישים במשותף IL-6 ו-TNFα (A) בו-זמנית ו-(B) ברצף, בהתאמה. (ג-ד) אחוז התאים המציגים הפרשה משותפת בו זמנית ורציפה של IL-6 ו- TNFα (n = 249), או IL-6 ו- IL-1β (n = 72), בהתאמה. הפרשה רציפה מוגדרת באמצעות השהיה בין התחלות הפרשת ציטוקינים של יותר מ-60 דקות. הצבעים מציינים מי מהציטוקינים התחיל להפריש ראשון. (ה-ו) הקשר בין זמני התחלת ההפרשה של הציטוקינים השונים עבור כל תא מפריש (nIL6-TNFα=249, nIL6-IL1β=72). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שחרור ציטוקינים והפרשת ציטוקינים נחקרים לעתים קרובות באימונולוגיה וברפואה קלינית³. הפרשת ציטוקינים לא מאוזנת עלולה להוביל להשפעות מזיקות בחולים הסובלים מזיהומים אך גם במחלות נוירולוגיות, דלקות או סרטן 26,27,28. אף על פי שחשיבותם לבריאות ולמחלות מבוססת היטב, חקר הציטוקינים והתאים המפרישים שלהם נותר מאתגר מכיוון שהמתודולוגיות הנוכחיות אינן מסוגלות לזהות ולכמת במדויק ציטוקינים שמקורם בתא בודד באופן שנפתר בזמן. עבור זרימת העבודה המוצגת כאן, נעשה שימוש בפרוטוקול גירוי מבוסס עם PBMC ונמדדה הפרשתם של IL-6, TNF-α ו- IL-1β. הבחירה להשתמש במרכזיות מרכזיות במקום בתת-אוכלוסיות בודדות ומטוהרות נבעה מהיישום הקודם לחקר תסמונות שחרור ציטוקינים (CRS)²³, מצב המאופיין בריכוזים גבוהים מאוד בפלזמה של ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל IL-6, TNF-α ו-IL-1β²⁹. מכיוון ש-CRS בדרך כלל לא קשור רק לאוכלוסייה אחת, השתמשנו ב-PBMCs מכיוון שהם יהיו נוכחים in vivo. עם זאת, ניתן לטהר ולהעריך תת-אוכלוסיות תאיות בנפרד, אם השאלה המדעית דורשת צעד זה. זמן הדגירה, תנאי הגירוי וטווחי הבדיקה הדינמיים הותאמו למדידת ההפרשה של שלושת הציטוקינים המעניינים. זרימת העבודה והנתונים המוצגים כאן מדגימים כיצד להגדיר, לכייל, לכמת, למדוד ולנתח הפרשה חד-תאית של ציטוקינים מרובים שנפתרה בזמן ונפתרה. פרוטוקול זה מספק תוכנית כיצד ניתוח רב-תפקודי של הפרשת ציטוקינים יכול לאפשר מגוון תפקודי ודינמי גדול של הציטוקינים המופרשים בחולים.

מספר היבטים מכריעים של פרוטוקול הבדיקה המתואר מאפשרים קריאה ביולוגית ייחודית. ראשית, אנקפסולציה של תא בודד בטיפות מיקרופלואידיות אפשרה חילוץ נתונים עבור כל תא בודד. אירועים של עטיפות תאים מרובות יכולים להיות מזוהים וממוינים פנימה או החוצה על ידי ניתוח תמונה, בהתאם לשאלת המחקר. שנית, הכללת מספר בדיקות חיסוניות פלואורסצנטיות בלתי תלויות בתוך הטיפות ויישור הננו-חלקיקים המתפקדים אפשרו מדידה כמותית של עד שלושה ריכוזי ציטוקינים במקביל. ריבוב זה איפשר ניתוח של דפוסי הפרשת ציטוקינים ברמה של תא בודד. שלישית, אימוביליזציה של הטיפות אפשרה מדידה בזמן וקורלציה של הפרשת ציטוקינים עבור כל תא מפריש ואפשרה להבחין בין זרם משותף לבין הפרשה רציפה. רזולוציית הזמן סיפקה באופן ייחודי נתונים על דפוסי הפרשה ותת-אוכלוסיות מסוגים שונים של מפרישים. לבסוף, ניתוח תמונה מקבילי איפשר חילוץ יעיל ומעקב אחר כמויות גדולות של נתונים ממדידות עם מעל 20,000 תאים בודדים. השאיבה מעקומות הפרשה בודדות אפשרה עוד יותר גילוי של תת-אוכלוסיות ותפקודים פנוטיפיים.

לצד הקריאה הייחודית שלו, לבדיקה יש גם יתרונות טכניים על פני ניתוח ציטוקינים סטנדרטי. הודות לגודלם הקטן של תאי האנקפסולציה של כ-60 pL, ניתן לזהות כמויות מוחלטות של ציטוקינים המופרשים ישירות מהמקור הביולוגי עם מגבלות גילוי המתאימות להפרשת תאים. מזעור הבדיקה משתמש גם בכמויות קטנות יותר של ביו-ריאגנטים יקרים. יתר על כן, ההתקנה דורשת מעט מאוד ציוד מיוחד, אשר לעתים קרובות כבר זמין במעבדות ביולוגיה וביו-הנדסה. מיקרוסקופים פלואורסצנטיים זמינים באופן נרחב, ומשאבות מזרקים משמשות לעתים קרובות במעבדות ביו-הנדסה או שניתן לרכוש אותן בעלות נמוכה יחסית. אם קיימת תרבית תאים, העלות עבור הציוד המלא הדרוש להפעלת הניסויים היא בסביבות 148,000 יורו, כאשר הרוב נתרם על ידי המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי האוטומטי (130,000 יורו). עם זאת, מכשיר כזה ניתן למצוא לעתים קרובות במעבדות ביולוגיות, ואת שאר העלות מופץ משאבת מזרק (13,000 יורו, אבל חלופות זולות יותר זמינים) וציוד קטן יותר. ייצור שבב הטיפות וחדר התצפית מתואר היטב¹⁷ וניתן לבצע אותו מחוץ לסביבת חדר נקי עם תשתיות נחוצות, כגון תנורים ומנקי פלזמה הנמצאים ברוב מעבדות הביו-הנדסה. לחלופין, ספקים שונים זמינים לספק למעבדות המעוניינות בכך שבבי מחולל טיפות. בשל הכמויות הקטנות הדרושות, הבדיקה חסכונית ופשוטה להתקנה.

כדי להבטיח את הרמה הגבוהה ביותר של יכולת שחזור, זיהינו כמה שלבים קריטיים להצלחת הפרוטוקול. בעיה נפוצה עבור משתמשים בפעם הראשונה היא תנועת טיפות במהלך המדידה. בעוד שתוכנת הניתוח יכולה לעקוב אחר טיפות בודדות במידה מסוימת, תנועה מוגזמת מובילה לאובדן רזולוציה של תא בודד ולתוצאות לא מדויקות. ניתן להימנע מתנועה על ידי שימוש בתאי מדידה אטומים כראוי, גודל טיפות וגודל תאים נכונים, תקופת שיווי משקל קצרה לפני תחילת המדידה וריכוז פעילי שטח תקין. שלב קריטי נוסף הוא מיקוד מדויק לפני תחילת המדידה. מיקוד לא נכון מוביל לירידה משמעותית בערכי העתקת הפלואורסצנטיות ולהערכת חסר של כמות הציטוקין המופרש. לבסוף, בהתאם לשאלה ולפרוטוקול שעל הפרק, תזמון נכון בין השלבים השונים הוא בעל חשיבות עליונה לשחזור. במיוחד זמן ההמתנה בין מילוי החדר לתחילת המדידה צריך להיות עקבי, אחרת חלון המדידה של הציטוקינים המופרשים עלול להתפספס.

מגבלות הטכנולוגיה המוצגת כוללות את היכולת המוגבלת להמשיך ולתפעל את התאים לאחר אנקפסולציה. לכן כיום לא ניתן להוסיף או להסיר ממריצים, נוגדנים או ריאגנטים נוספים. בנוסף, מאחר שהתאים עטופים בביוריאקטור המבודד שלהם, לא יכולות להתרחש אינטראקציות בין תאים (איתות מבוסס מגע או פרקריני) במהלך המדידה. מגבלה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי דגירות בתפזורת מראש. מלבד זאת, השפעות אוטוקריניות משופרות מציטוקינים מופרשים אפשריות גם כן ולא ניתן לכמת או לשלול השפעות אלה בוודאות, מכיוון שרק ציטוקינים המופרשים שזוהו על ידי נוגדנים נמדדים. לכן, ההשקפה המבודדת על הפרשת ציטוקינים חייבת תמיד להיות מתוארת בהקשר של השאלה והיישום המתאימים. עם זאת, מגבלה זו יכולה לשמש גם למחקר מפורט של כפולות, כפילים ושלישיות אם הם מעניינים. זה יספק מערך מעניין שימושי לחקור מגע בין תאים או שאלות מבוססות פרקרינה. לבסוף, גם הטווח הדינמי של הבדיקה מוגבל וצריך התאמה ליישום הספציפי. כאן, התאמנו את הטווח הדינמי של הבדיקה לכמות המופרשת הצפויה של הציטוקינים שנמדדו.

כדי לקדם עוד יותר את היכולות והישימות של הבדיקה, ניתן יהיה להתייחס בעתיד למספר פיתוחים, בהיבטים ביולוגיים, טכניים וניתוח נתונים. בצד הביולוגי, ניתן לשלב מדידה של ציטוקינים נוספים, חלבונים מופרשים אחרים, סמנים מטבוליים או פני השטח של התא על ידי התאמת הבדיקה. יתר על כן, בדיקה זו יכולה להיות משולבת בתהליך עבודה לצד בדיקות מבוססות תאים אחרות כדי להרחיב את הקריאות (למשל, צביעת ציטומטריה זרימה או ריצוף). בנוסף, ניתן לפשט את השימושיות של הבדיקה, למשל, על ידי יצירת שבב מיקרופלואידי משולב ליצירת טיפות ותצפית, ובכך לאפשר יישום רחב יותר מחוץ למעבדות ביו-הנדסה בסביבה קלינית. בנוגע לניתוח נתונים, ניתן להרחיב את החילוץ והמעקב אחר מידע מתמונות על ידי שיפור האוטומציה ושימוש בגישות של למידת מכונה, למשל, כדי לזהות את הנוכחות והמיקום של התא(ים) וקו החרוזים בכל טיפה ללא תיוג פלואורסצנטי. פעולה זו תפתח תעלות פלואורסצנטיות נוספות שיוכלו לשמש לבדיקות חיסוניות, וכתוצאה מכך למדוד עוד יותר ציטוקינים במקביל.

ניתן ליישם את הבדיקה המוצגת ואת הפרוטוקולים והניתוחים הקשורים אליה עבור מקרי שימוש פוטנציאליים מגוונים הקשורים לדינמיקה של הפרשת ציטוקינים. באופן ספציפי יותר, הבדיקה עשויה לענות על שאלות אימונולוגיות בסיסיות כגון זיהוי פרופילי הפרשת ציטוקינים ספציפיים לסוג התא ולהפעלה, פוליפונקציונליות של תאים מפרישי ציטוקינים, או מנגנוני הזמניות והתחזוקה של מאזני ציטוקינים. יתר על כן, ביישומים קליניים, הפלטפורמה עשויה לאפשר את חשיפת תפקידם של הציטוקינים במהלך תגובות דלקתיות פעילות או כרוניות, כפי שנצפה ב- COVID-19³⁰, או לספק כלי לריבוד חולים והתאמה אישית של טיפולים על בסיס חתימות ייחודיות כגון בדלקת אוטומטית³¹. לסיכום, הערכה כמותית בזמן של הפרשת ציטוקינים מתאים בודדים היא שיטה נחוצה מאוד, שכן היא מבהירה כיצד תרופה מסוימת, זיהום, שינוי גנטי או גירוי ex vivo מעוררים תגובה מסוימת.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך על ידי מענק #2021-349 של אזור המיקוד האסטרטגי בריאות מותאמת אישית וטכנולוגיות קשורות (PHRT) של תחום ETH (המכונים הפדרליים השוויצריים לטכנולוגיה), מענק ההתחלה של מועצת המחקר האירופית (מענק #803,336), והקרן הלאומית למדע שוויצרית (מענק #310030_197619). בנוסף, אנו מודים לגילהם שנון וז’אן בודרי על עבודתם ופיתוח מנתח DropMap הראשוני.

Materials

008-FluoroSurfactant	RAN Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-10G
2-Stream flow-focusing droplet maker, 30 µm nozzle, PFOS hydrophobic surface treatment	Wunderli chips
Alexa Fluor 647 NHS Ester	ThermoFisher	A20006	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html
Anti-Human IL-1β (Monoclonal Mouse), AF647 labelled in-house	PeproTech	500-M01B
ARcare92524 double-sided adhesive tape	Adhesvies Reasearch	ARcare92524
Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm	Ademtech	Cat#03233
Biotinylated Goat Anti-Human IL-1β	PeproTech	500-P21BGBT
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059
Cell Scraper	TPP	99002
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34557	Cell staining solution
Chromafil Xtra PTFE-45/25 syringe filters	Macherey-Nagel	729205
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment	Corning	3471
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D-Biotin	Fluorochem	M02926
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14196-094
epT.I.P.S. Standard 2-200 µl	Eppendorf	30000889
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution	Sigma-Aldrich	3690
EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotin	ThermoFisher	A39259	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Handy dish soap	Migros	5.01002E+11
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
HFE-7500 Oil 3M TM Novec	Fluorochem	B40045191
Idex F-120 Fingertight One-Piece Fitting, Standard Knurl, Natural PEEK, 1/16" OD Tubing, 10-32 Coned	Cole-Parmer	GZ-02014-15
IL-6 Monoclonal Antibody (MQ2-13A5 – Rat), FITC	ThermoFisher	11-7069-81
IL-6 Monoclonal Antibody (MQ2-39C3), Biotin	ThermoFisher	13-7068-85
KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher	10828-010
Loctite AA 3491 curable UV glue	Henkel AG & Co	3491
Microscope slides (76x26x1mm, clear white)	Menzel Gläser
Mineral oil light	Sigma-Aldrich	330779
NanoPort Assembly Headless, 10-32 Coned, for 1/16" OD	Idex	N-333
Neodymium block magnet	K&J Magnetics	BZX082
Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS	Braun	9161406V
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	ThermoFisher	P6866
Precision wipes	Kimtech Science	5511
PTFE microtubing 0.30 × 0.76 mm	FisherScientific	1191-9445
PTFE microtubing 0.56 × 1.07 mm	FisherScientific	1192-9445
Recombinant Human IL-1β	Peprotech	Cat#200-01B
Recombinant Human IL-6	Peprotech	Cat#200-06
Recombinant human serum albumine (HSA)	Sigma-Aldrich	A9731
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	Cat#300-01A
Reusable biopsy punch diameter 0.75 mm and 6 mm	Stiefel	504529 and 504532
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Gibco	11835-030
Standard LPS, E. coli K12	InvivoGen	tlrl-eklps
Sterican needles 23 G for 0.56 mm diameter microtubing	FisherScientific	15351547
Sterican needles 27 G for 0.30mm diameter microtubing	FisherScientific	15341557
TNF alpha Monoclonal Antibody (MAb11), PE	ThermoFisher	12-7349-81
TNF-alpha Monoclonal Antibody (MAb1), biotinylated in-house	ThermoFisher	14-7348-85
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	T10282
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99500
Devices
Cameo 4 automatic cutting machine	Silhouette
Cetoni Base 120 + 3x NEMESYS Low Pressure Syringe Pumps	Cetoni	NEM-B101-03 A
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher
Inverted Epi-fluorescence microscope Ti2	Nikon	ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1
OKO Lab Cage Incubator, dark panels	OKO Lab
ORCA-Fusion Digital CMOS camera	Hammatsu	C14440
SOLA Light Engine	Lumencor	sola 80-10247

References

Chen, L., et al. Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs. Oncotarget. 9 (6), 7204-7218 (2017).
Cicchese, J. M., et al. Dynamic balance of pro- and anti-inflammatory signals controls disease and limits pathology. Immunol Rev. 285 (1), 147-167 (2018).
Liu, C., et al. Cytokines: From clinical significance to quantification. Adv Sci. 8 (15), e2004433 (2021).
Rojas, J. M., Avia, M., Martín, V., Sevilla, N. IL-10: A multifunctional cytokine in viral infections. J Immunol Res. 2017, 6104054 (2017).
Kohanawa, Y. M. A regulatory effect of the balance between TNF-α and IL-6 in the granulomatous and inflammatory response to Rhodococcus aurantiacus infection in mice. J Immunol. 177 (1), 642-650 (2006).
Geginat, J., et al. Plasticity of human CD4 T cell subsets. Front Immunol. 5, 630 (2014).
Sallusto, F. Heterogeneity of human CD4+ T cells against microbes. Ann Rev Immunol. 34 (1), 317-334 (2016).
Chetaille Nézondet, A. L., Poubelle, P. E., Pelletier, M. The evaluation of cytokines to help establish diagnosis and guide treatment of autoinflammatory and autoimmune diseases. J Leukocyte Biol. 108 (2), 647-657 (2020).
Sims, J. T., et al. Characterization of the cytokine storm reflects hyperinflammatory endothelial dysfunction in COVID-19. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 107-111 (2021).
Yasen, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the heterogeneity of infiltrating immune cell profiles in the hepatic cystic echinococcosis microenvironment. Infection and Immunity. 89 (12), (2021).
Jiang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing highlights intratumor heterogeneity and intercellular network featured in adamantinomatous craniopharyngioma. Sci Adv. 9 (15), (2023).
Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
Bucheli, O. T. M., Sigvaldadóttir, I., Eyer, K. Measuring single-cell protein secretion in immunology: Technologies, advances, and applications. Eur J Immunol. 51 (6), 1334-1347 (2021).
Brower, K. K., et al. Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery. Lab Chip. 20 (12), 2062-2074 (2020).
Brower, K. K., et al. Double emulsion picoreactors for high-throughput single-cell encapsulation and phenotyping via FACS. Anal Chem. 92 (19), 13262-13270 (2020).
Luo, X., Chen, J. Y., Ataei, M., Lee, A. Microfluidic compartmentalization platforms for single cell analysis. Biosensors. 12 (2), 58 (2022).
Bounab, Y., et al. Dynamic single-cell phenotyping of immune cells using the microfluidic platform DropMap. Nat Protoc. 15 (9), 2920-2955 (2020).
Eyer, K., et al. Single-cell deep phenotyping of IgG-secreting cells for high-resolution immune monitoring. Nat Biotechnol. 35 (10), 977-982 (2017).
Gaa, R., et al. Versatile and rapid microfluidics-assisted antibody discovery. mAbs. 13 (1), 198130 (2021).
Gerard, A., et al. High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics. Nat Biotechnol. 38 (6), 715-721 (2020).
De Jonghe, J., et al. spinDrop: a droplet microfluidic platform to maximise single-cell sequencing information content. Nat Comm. 14 (1), 4788 (2023).
Wheeler, M. A., et al. Droplet-based forward genetic screening of astrocyte-microglia cross-talk. Science. 379 (6636), 1023-1030 (2023).
Portmann, K., Linder, A., Oelgarth, N., Eyer, K. Single-cell deep phenotyping of cytokine release unmasks stimulation-specific biological signatures and distinct secretion dynamics. Cell Rep Meth. 3 (7), 100502 (2023).
Portmann, K., Linder, A., Eyer, K. Stimulation-induced cytokine polyfunctionality as a dynamic concept. eLife. 12, 89781 (2023).
Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev. 29, S49-S52 (2008).
Yang, J., et al. New insight into neurological degeneration: Inflammatory cytokines and blood-brain barrier. Front Mol Neurosci. 15, 1013933 (2022).
Kim, P. S., Ahmed, R. Features of responding T cells in cancer and chronic infection. Curr Opin Immunol. 22 (2), 223-230 (2010).
Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17 (1), 49-59 (2017).
Cosenza, M., Sacchi, S., Pozzi, S. Cytokine release syndrome associated with T-cell-based therapies for hematological malignancies: Pathophysiology, clinical presentation, and treatment. Int J Mol Sci. 22 (14), 7652 (2021).
Hu, B., Huang, S., Yin, L. The cytokine storm and COVID-19. J Med Virol. 93 (1), 250-256 (2021).
Marcuzzi, A., et al. Autoinflammatory diseases and cytokine storms-Imbalances of innate and adaptative immunity. Int J Mol Sci. 22 (20), 11241 (2021).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Linder, A., Portmann, K., Schlotheuber, L. J., Streuli, A., Glänzer, W. S., Eyer, K., Lüchtefeld, I. Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells . J. Vis. Exp. (205), e66492, doi:10.3791/66492 (2024).

Automatically Generated