نهج الموائع الدقيقة لحل إفراز السيتوكين المتزامن والمتسلسل للخلايا الفردية متعددة الوظائف
Summary
يصف البروتوكول منصة الموائع الدقيقة المتقدمة لقياس ديناميكيات إفراز السيتوكين لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية الفردية. تقيس المنصة ما يصل إلى ثلاثة سيتوكينات بالتوازي (IL-6 و TNFα و IL-1β) لكل خلية فردية يتم تحفيزها باستخدام عديد السكاريد الدهني كمثال.
Abstract
يمكن أن تؤدي العدوى وأمراض المناعة الذاتية والاستجابات المناعية المرغوبة والسلبية للعلاج إلى استجابة معقدة وديناميكية للسيتوكين في الجسم الحي. تتضمن هذه الاستجابة العديد من الخلايا المناعية التي تفرز العديد من السيتوكينات لتنظيم التفاعل المناعي. ومع ذلك ، فإن ديناميكيات الإفراز والكميات والحدوث المشترك للسيتوكينات المختلفة حسب الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد بسبب نقص الأدوات المناسبة لدراستها. هنا ، نصف بروتوكولا باستخدام منصة قطرات الموائع الدقيقة التي تسمح بالقياس الكمي الذي تم حله زمنيا لديناميكيات الإفراز للعديد من السيتوكينات بالتوازي على مستوى الخلية الواحدة. يتم تمكين ذلك من خلال تغليف الخلايا الفردية في قطرات الموائع الدقيقة جنبا إلى جنب مع مقايسة مناعية متعددة الإرسال للقياس الكمي المتوازي لتركيزات السيتوكين ، وتجميدها للتصوير الفلوري الديناميكي ، وتحليل الصور المعنية لاشتقاق الكميات والديناميكيات المفرزة. يصف البروتوكول تحضير الجسيمات النانوية المغناطيسية الوظيفية ، وتجارب المعايرة ، وإعداد الخلايا ، وتغليف الخلايا والجسيمات النانوية في قطرات للتصوير الفلوري وتحليل الصور والبيانات اللاحقة باستخدام مثال خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحفزة عديد السكاريد الشحمي. حددت المنصة المقدمة سلوك إفراز السيتوكين المتميز للخلايا المفردة والمشتركة ، مما يميز عدم التجانس الظاهري المتوقع في عينة الخلية المقاسة. علاوة على ذلك ، تسمح الطبيعة المعيارية للفحص بتكييفه وتطبيقه لدراسة مجموعة متنوعة من البروتينات والسيتوكينات وعينات الخلايا ، مما قد يؤدي إلى فهم أعمق للتفاعل بين أنواع الخلايا المناعية المختلفة ودور السيتوكينات المختلفة التي تفرز ديناميكيا لتشكيل الاستجابة المناعية المنظمة بإحكام. يمكن أن تكون هذه الأفكار الجديدة مثيرة للاهتمام بشكل خاص في دراسات عدم التنظيم المناعي أو في تحديد السكان المستهدفين في العلاج وتطوير الأدوية.
Introduction
غالبا ما تسبب العدوى تفاعلات مضيفة معقدة تشمل جهاز المناعة الفطري والتكيفي 1,2. عند الإصابة أو التعرف على العوامل المعدية ، يمكن للخلايا المضيفة إنتاج مجموعة متنوعة من الكيماويات والسيتوكينات ، وهي بروتينات صغيرة تعرف باسم الاتصالات الحرجة وتعديل الجهاز المناعي3. يتم إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في وقت مبكر من الإصابة لبدء الاستجابة المناعية ، تليها لاحقا السيتوكينات المضادة للالتهابات ، والتي تعتبر ضرورية لمنع تلف الأنسجة والأمراض المزمنة أو الالتهابية الذاتية اللاحقة. يتجلى هذا التوازن بين القضاء على التهديد وحماية الأنسجة كذخيرة واسعة من السيتوكينات التي تمارس وظائف مختلفة أثناء العدوى ، مما يسمح بضبط الاستجابة 4,5. داخل هذا الخليط، يمكن ملاحظة التوقيعات الفريدة اعتمادا على مسبب المرض والإشارات التي يحفزها، وموقع الأنسجة، والخلايا المناعية التي تنشأ منها. ومع ذلك ، يبدو أن إطلاق السيتوكين يشكل أيضا عملية بيولوجية متعددة الوظائف فريدة من نوعها لكل مجموعة من الخلايا ، ومتنوعة في ديناميكيات الإفراز والاستجابة الفردية. تم وصف عدم التجانس هذا في الأدبيات لسنوات عديدة ، على سبيل المثال ، بين المجموعات السكانية الفرعيةللخلايا التائية 6,7 ، حيث أظهرت التحقيقات في الأمراض الالتهابية الذاتية والتهابات COVID-19 الشديدة تنوعا وظيفيا كبيرا لعلامات الالتهاب داخل وبين المرضى 8,9. في الآونة الأخيرة ، سلط ظهور تسلسل الخلية الواحدة الضوء على اللدونة العالية والحديث المتبادل بين المجموعات السكانية الفرعية داخل البيئات الدقيقة المناعية التي لم تكن واضحة من قبل ، مما يشير إلى أن طرق الخلية الواحدة ضرورية لالتقاط هذا عدم التجانس10,11. بينما يتم تطوير طرق جديدة لتحليل النسخ ، لا يزال تحليل النمط الظاهري يمثل تحديا ، لأن هذا يتطلب قياسات متزامنة وكمية وزمنية لإفراز البروتين على مستوى خلية واحدة. تسمح لنا هذه القياسات بالتحقيق في هويات الخلايا المفرزة وديناميكياتها وأنماط الإفراز (بطيئة / سريعة ، مبكرة / متأخرة ، متزامنة / متسلسلة) لذخيرة أو لوحة من السيتوكينات. من خلال تمكين دراسة ديناميكيات إطلاق السيتوكين أثناء الاستجابة المناعية كميا وبدقة زمنية ، قد تسمح الأفكار الناتجة بفهم المجموعة الخلوية والاستجابة المستحثة.
في البروتوكولات القياسية ، عادة ما يتم الكشف عن السيتوكينات في طاف معلقات الخلايا والمصل باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، مما ينتج عنه كميات مفرزة بكميات كبيرة. لا تسمح القياسات السائبة بالقياس الكمي لكميات السيتوكين التي تنتجها كل خلية ، وهي مشكلة تم تسليط الضوء عليها بشكل خاص في عينات الخلايا غير المتجانسة. تكتشف الطرق البديلة مثل تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا أو مقايسة البقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISpot) أو المقايسات المحفورة الدقيقة (على سبيل المثال ، Isoplexis) السيتوكينات التي تعبر عنها الخلايا الفردية ولكنها توفر قياسات نقطة النهاية فقط12,13. هذا يعني تجاهل ديناميكيات الإفراز والتغيرات التي قد تحدث في نمط الإفراز الخلوي خلال فترة الحضانة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن لقياسات نقطة النهاية التمييز بين إفراز السيتوكين المتزامن والمتسلسل ، لذلك يظل المدى الحقيقي لتعدد الوظائف المتزامنة للخلايا المناعية في إفراز السيتوكين غير واضح باستخدام هذه الطرق.
يمكن تحقيق دقة الخلية الواحدة باستخدام الموائع الدقيقة القطيرية لتوليد ومعالجة مقصورات مادية بحجم بيكولتر من أجل دراسة الخلايا المناعية على الأنماط الظاهرية الفريدة لإفراز السيتوكين على مستوى الخليةالواحدة 14,15. تتكون هذه المقصورات من مستحلبات الماء في الزيت ويمكن توليدها باستخدام رقائق الموائع الدقيقة16,17. في الواقع ، أظهرت مقايسات الموائع الدقيقة القائمة على القطيرات تنوعا شديدا في تمكين تحليل العينات والذخيرة البيولوجية المختلفة على مستوى الخلية الواحدة وتكاملها مع المنبع (معالجة الخلايا والكواشف) وعمليات المصب (فرز الخلية الواحدة أو البروتينات أو التسلسل)18،19،20،21،22. على وجه الخصوص ، تسمح الإعدادات التي تسمح بتثبيت القطيرات بقياس وظيفة الخلية الواحدة بمرور الوقت ، وهو أمر مهم لتحليل إفراز البروتين18. علاوة على ذلك ، فإن دمج المقايسات الكمية متعددة الإرسال يسهل إجراء تحقيقات إضافية في أبعاد لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقا ، في عمليات مثل الإفراز المشترك وتحديد الخلايا المناعية متعددة الوظائف23,24.
في هذا البروتوكول ، نصف سير عمل أحادي الخلية قائم على القطيرات الثابتة لاكتشاف وقياس وقياس إفراز ما يصل إلى ثلاثة سيتوكينات بالتوازي من الخلايا الفردية17,23. توفر هذه التقنية القدرة على مراقبة استجابات السيتوكين من أكثر من 20000 خلية بالتوازي.
يتكون سير العمل المقدم من تغليف الموائع الدقيقة للخلايا المناعية المفردة والجسيمات النانوية الوظيفية في قطرات ماء في زيت 60 pL. يسمح تجميد >100000 قطرة في غرفة المراقبة والفحص المجهري الفلوري الذي تم حله بمرور الوقت بقياس ديناميكيات إفراز السيتوكين داخل كل قطرة وكل سيتوكين (الشكل 1 أ). لكل خلية فردية داخل قطرة ، يتم قياس إفراز السيتوكين بواسطة مقايسة مناعية شطيرة ، حيث تربط الجسيمات النانوية المغناطيسية التي تعمل بجسم مضاد التقاط محدد السيتوكين المفرز ، مما يؤدي إلى النقل اللاحق وربط الأجسام المضادة للكشف الموسومة بالفلورسنت (الشكل 1B ، C). يتم تشكيل خط الخرز عن طريق محاذاة الجسيمات النانوية المغناطيسية ، والتي يمكن تحديد انتقال التألق إليها في وجود السيتوكين. هنا ، يتم تعريف نقل التألق على أنه متوسط شدة التألق الموجود على خط الخرز مقسوما على متوسط شدة التألق للقطرة المتبقية. يمكن مضاعفة هذا الفحص للعديد من السيتوكينات عن طريق خلط دفعات الجسيمات النانوية ذات الوظائف المختلفة والأجسام المضادة للكشف ذات الصلة الموسومة في قنوات مضان مختلفة23 ، مما يؤدي إلى عمليات نقل مضان محددة في القنوات المختلفة. بمساعدة برنامج نصي مخصص للتحليل ، يمكن استخراج قيم نقل التألق ، ويمكن تحويل الصور إلى ملفات تعريف ديناميكية إفرازية لكل خلية فردية وسيتوكين. لذلك ، فإن مجموعات البيانات الناتجة تنتج العديد من القراءات ، مثل قياس الإفراز الكمي بمرور الوقت ، وتحديد المجموعات السكانية الفرعية المشتركة ، وتوزيعات الخلايا وفقا للكميات المفرزة ، والمعدلات ، ومجموعات السيتوكينات.
الشكل 1: سير العمل ومبدأ الفحص. أ: نظرة عامة على سير العمل لتحليل الخلايا المفرزة للسيتوكينات بعد التحفيز. يتم تحضير معلقات أحادية الخلية وجسيمات نانوية مغناطيسية وتغليفها في 60 مل في مستحلبات الزيت / الماء الحجمية (قطرات). يتم تثبيت القطرات ومحاذاة الجسيمات النانوية داخل مجال مغناطيسي قبل القياس لمدة تصل إلى 4 ساعات كل 30 دقيقة. أخيرا ، يتم تحليل الصور ، ويتم استخراج المعلمات لكل قطرة ونقطة زمنية وقناة فلورسنت. وقد عدل هذا الرقم من17. (ب) مبدأ المقايسة الحيوية لشطيرة القطيرات. تربط الجسيمات النانوية الوظيفية السيتوكينات المفرزة ، مما يؤدي إلى النقل اللاحق للأجسام المضادة للكشف ذات العلامات الفلورية إلى الجسيمات النانوية. يتم تحديد هذا النقل للتألق والتحقق من صحته من خلال تجارب المعايرة التي أجريت باستخدام السيتوكينات المؤتلفة. يسمح خلط الجسيمات النانوية الوظيفية المختلفة بإجراء قياسات متعددة لما يصل إلى ثلاثة سيتوكينات في وقت واحد. (ج) في التجارب القائمة على الخلايا، تتبع القطرات خلال زمن القياس، ويتم تحديد الخلايا المفرزة من خلال زيادة الوقت الإضافي في انتقال التألق إلى الجسيمات النانوية. المخططات ليست على نطاق واسع. تم إنشاء الشكل باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
كثيرا ما يتم التحقيق في إطلاق السيتوكين وإفرازه في علم المناعة والطب السريري3. يمكن أن يؤدي إفراز السيتوكين غير المتوازن إلى آثار ضارة للمرضى الذين يعانون من الالتهابات ولكن أيضا في الأمراض العصبية أو الالتهاب أو السرطان26،27،28. على الرغم من أن أهميتها في الصحة والمرض راسخة ، إلا أن دراسة السيتوكينات وخلاياها المفرزة لا تزال صعبة لأن المنهجيات الحالية غير قادرة على الكشف بدقة عن السيتوكينات الناشئة من خلية واحدة وقياسها بطريقة تم حلها بمرور الوقت. بالنسبة لسير العمل المقدم هنا ، تم استخدام بروتوكول تحفيز ثابت مع PBMC وتم قياس إفرازها من IL-6 و TNF-α و IL-1β. نشأ اختيار استخدام PBMCs بدلا من المجموعات السكانية الفرعية الفردية المنقاة من التطبيق السابق للتحقيق في متلازمات إطلاق السيتوكين (CRS)23 ، وهي حالة تتميز بتركيزات بلازمية مرتفعة للغاية من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك IL-6 و TNF-α و IL-1β29. نظرا لأن CRS لا يرتبط عادة بمجموعة سكانية واحدة فقط ، فقد استخدمنا PBMCs لأنها ستكون موجودة في الجسم الحي. ومع ذلك ، يمكن تنقية المجموعات الفرعية الخلوية وتقييمها بشكل فردي ، إذا كان السؤال العلمي يتطلب هذه الخطوة. تم تحسين وقت الحضانة وظروف التحفيز ونطاقات الفحص الديناميكي لقياس إفراز السيتوكينات الثلاثة ذات الأهمية. يوضح سير العمل والبيانات المعروضة هنا كيفية إعداد ومعايرة وقياس وقياس وتحليل إفراز الخلية الواحدة الذي تم حله بمرور الوقت لسيتوكينات متعددة. يوفر هذا البروتوكول مخططا حول كيف يمكن للتحليل متعدد الوظائف لإفراز السيتوكين أن يتيح التنوع الوظيفي والديناميكي الكبير للسيتوكين الذي يفرز في المرضى.
تتيح العديد من الجوانب الحاسمة لبروتوكول الفحص الموصوف قراءات بيولوجية فريدة. أولا ، سمح تغليف الخلية الواحدة في قطرات الموائع الدقيقة باستخراج البيانات لكل خلية على حدة. يمكن الكشف عن أحداث تغليف الخلايا المتعددة وفرزها داخل أو خارج عن طريق تحليل الصور ، اعتمادا على سؤال البحث. ثانيا ، سمح إدراج العديد من المقايسات المناعية الفلورية المستقلة في القطيرات ومحاذاة الجسيمات النانوية الوظيفية بالقياس الكمي لما يصل إلى ثلاثة تركيزات من السيتوكين بالتوازي. مكن هذا الإرسال المتعدد من تحليل أنماط إفراز السيتوكين المشترك على مستوى خلية واحدة. ثالثا ، سمح تجميد القطرات بالقياس الزمني وارتباط إفراز السيتوكين لكل خلية إفرازية وسمح بالتمييز بين الإفراز المشترك والإفراز المتسلسل. قدمت دقة الوقت بشكل فريد بيانات عن أنماط الإفراز والمجموعات السكانية الفرعية لأنواع الإفرازات المختلفة. وأخيرا، مكن تحليل الصور المتوازي من استخراج وتتبع كميات كبيرة من البيانات بكفاءة من القياسات مع أكثر من 20000 خلية فردية. سمح الاستخراج من منحنيات الإفراز الفردي باكتشاف مجموعات فرعية من النمط الظاهري ووظائفه.
بجانب قراءته الفريدة ، يتمتع الفحص أيضا بمزايا تقنية مقارنة بتحليل السيتوكين القياسي. بفضل الحجم الصغير لحجرات التغليف التي تبلغ حوالي 60 مل ، يمكن اكتشاف كميات مطلقة من السيتوكينات المفرزة مباشرة من المصدر البيولوجي مع حدود الكشف التي تناسب إفراز الخلية. يستخدم تصغير الفحص أيضا كميات أقل من الكواشف الحيوية باهظة الثمن. علاوة على ذلك ، يتطلب الإعداد القليل جدا من المعدات المتخصصة ، والتي غالبا ما تكون متاحة بالفعل في مختبرات البيولوجيا والهندسة الحيوية. تتوفر المجاهر الفلورية على نطاق واسع ، وكثيرا ما تستخدم مضخات الحقن في مختبرات الهندسة الحيوية أو يمكن شراؤها بتكلفة منخفضة نسبيا. في حالة وجود مزرعة خلوية ، تبلغ تكلفة المعدات الكاملة اللازمة لإجراء التجارب حوالي 148000 يورو ، مع مساهمة الغالبية بواسطة المجهر الفلوري الآلي (130000 يورو). ومع ذلك ، يمكن العثور على مثل هذه الأداة في كثير من الأحيان في المختبرات البيولوجية ، ويتم توزيع بقية التكلفة على مضخة الحقنة (13000 يورو ، ولكن تتوفر بدائل أرخص) ومعدات أصغر. تم وصف تصنيع رقاقة القطيرات وغرفة المراقبة بشكل جيد للغاية17 ويمكن إجراؤها خارج بيئة غرف الأبحاث مع البنية التحتية اللازمة ، مثل الأفران ومنظفات البلازما الموجودة في معظم مختبرات الهندسة الحيوية. بدلا من ذلك ، يتوفر موردون مختلفون لتزويد المختبرات المهتمة برقائق مولد القطيرات. نظرا للأحجام الصغيرة المطلوبة ، فإن الفحص فعال من حيث التكلفة وسهل الإعداد.
لضمان أعلى درجة من التكرار ، حددنا بعض الخطوات الحاسمة لنجاح البروتوكول. مشكلة شائعة للمستخدمين لأول مرة هي حركة القطيرات أثناء القياس. في حين أن برنامج التحليل يمكنه تتبع القطرات الفردية إلى حد ما ، فإن الحركة المفرطة تؤدي إلى فقدان دقة الخلية الواحدة والنتائج غير الدقيقة. يمكن تجنب الحركة باستخدام غرف قياس محكمة الإغلاق بشكل صحيح ، وحجم القطرات الصحيح وأحجام الغرف ، وفترة توازن قصيرة قبل بدء القياس ، وتركيز الفاعل بالسطح المناسب. خطوة أخرى حاسمة هي التركيز الدقيق قبل بدء القياس. يؤدي التركيز غير السليم إلى انخفاض كبير في قيم نقل التألق والتقليل من كمية السيتوكين المفرز. أخيرا ، اعتمادا على السؤال والبروتوكول المطروح ، يعد التوقيت الصحيح بين الخطوات المختلفة ذا أهمية قصوى لقابلية التكاثر. يجب أن يكون وقت الانتظار بين ملء الغرفة وبدء القياس متسقا ، وإلا فقد يتم تفويت نافذة قياس السيتوكينات المفرزة.
تشمل قيود التكنولوجيا المقدمة القدرة المحدودة على زيادة التلاعب بالخلايا بعد التغليف. لذلك لا يمكن حاليا إضافة أو إزالة المنشطات أو الأجسام المضادة أو الكواشف الإضافية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الخلايا مغلفة في مفاعلها الحيوي المعزول ، فلا يمكن إجراء تفاعلات بين الخلايا (الإشارات القائمة على الاتصال أو paracrine) أثناء القياس. يمكن التغلب على هذا القيد جزئيا من خلال الحضانة السائبة مسبقا. إلى جانب ذلك ، من الممكن أيضا تعزيز تأثيرات autocrine من السيتوكينات المفرزة ولا يمكن تحديد هذه التأثيرات أو استبعادها على وجه اليقين ، حيث يتم قياس السيتوكينات المفرزة المكتشفة بالأجسام المضادة فقط. لذلك ، يجب دائما وصف وجهة النظر المعزولة حول إفراز السيتوكين في سياق السؤال والتطبيق المقابلين. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا القيد للدراسة التفصيلية للمضاعفات المغلفة والمزدوجة والثلاثية إذا كانت ذات أهمية. سيوفر هذا إعدادا مثيرا للاهتمام مفيدا للتحقيق في الاتصال بالخلية أو الأسئلة القائمة على paracrine. أخيرا ، النطاق الديناميكي للفحص محدود ويحتاج إلى التكيف مع التطبيق المحدد. هنا ، قمنا بتكييف النطاق الديناميكي للفحص مع الكمية المفرزة المتوقعة من السيتوكينات المقاسة.
ولزيادة تعزيز قدرات الفحص وإمكانية تطبيقه، يمكن معالجة العديد من التطورات في المستقبل، في الجوانب البيولوجية والتقنية وتحليل البيانات. على الجانب البيولوجي ، يمكن دمج قياس السيتوكينات الإضافية أو البروتينات المفرزة الأخرى أو علامات التمثيل الغذائي أو سطح الخلية عن طريق تكييف الفحص. علاوة على ذلك ، يمكن دمج هذا الفحص في سير العمل جنبا إلى جنب مع المقايسات الأخرى القائمة على الخلايا لتوسيع القراءات (على سبيل المثال ، تلطيخ التدفق الخلوي أو التسلسل). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تبسيط قابلية استخدام الفحص ، على سبيل المثال ، عن طريق إنشاء شريحة موائع دقيقة متكاملة لإنشاء القطيرات ومراقبتها ، مما قد يتيح تطبيقا أوسع خارج مختبرات الهندسة الحيوية في بيئة سريرية. فيما يتعلق بتحليل البيانات ، يمكن توسيع استخراج وتتبع المعلومات من الصور من خلال تعزيز الأتمتة واستخدام نهج التعلم الآلي ، على سبيل المثال ، للكشف عن وجود وموضع الخلية (الخلايا) وخط الخرز في كل قطرة دون وضع علامات على الفلورسنت. سيؤدي القيام بذلك إلى فتح قنوات فلورية إضافية يمكن استخدامها للمقايسات المناعية ، مما يؤدي إلى قياس المزيد من السيتوكينات بالتوازي.
يمكن تطبيق الفحص المقدم والبروتوكولات والتحليلات المرتبطة به على حالات الاستخدام المحتملة المتنوعة المتعلقة بديناميكيات إفراز السيتوكينات. وبشكل أكثر تحديدا ، يمكن أن يعالج الفحص الأسئلة المناعية الأساسية مثل تحديد نوع الخلية وملفات إفراز السيتوكين الخاصة بالتنشيط ، أو تعدد وظائف الخلايا المفرزة للسيتوكين ، أو الآليات الزمنية والصيانة لأرصدة السيتوكينات. علاوة على ذلك ، في التطبيقات السريرية ، قد تمكن المنصة من كشف دور السيتوكينات أثناء الاستجابات الالتهابية النشطة أو المزمنة ، كما لوحظ في COVID-1930 ، أو توفر أداة لتقسيم المرضى إلى طبقات وتخصيص العلاجات بناء على توقيعات فريدة كما هو الحال في الالتهاب الذاتي31. في الختام ، يعد التقييم الكمي الذي تم حله زمنيا لإفراز السيتوكين من الخلايا المفردة طريقة مطلوبة بشدة لأنه يوضح كيف يؤدي دواء معين أو عدوى أو تغيير جيني أو تحفيز خارج الجسم الحي إلى استجابة معينة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا المشروع من خلال المنحة # 2021-349 من مجال التركيز الاستراتيجي للصحة الشخصية والتقنيات ذات الصلة (PHRT) لمجال ETH (المعاهد الفيدرالية السويسرية للتكنولوجيا) ، ومنحة بدء مجلس البحوث الأوروبي (منحة # 803,336) ، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة #310030_197619). بالإضافة إلى ذلك ، نشكر Guilhem Chenon و Jean Baudry على عملهما وتطوير محلل DropMap الأولي.
Materials
| 008-FluoroSurfactant | RAN Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-10G | |
| 2-Stream flow-focusing droplet maker, 30 µm nozzle, PFOS hydrophobic surface treatment | Wunderli chips | ||
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | ThermoFisher | A20006 | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html |
| Anti-Human IL-1β (Monoclonal Mouse), AF647 labelled in-house | PeproTech | 500-M01B | |
| ARcare92524 double-sided adhesive tape | Adhesvies Reasearch | ARcare92524 | |
| Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm | Ademtech | Cat#03233 | |
| Biotinylated Goat Anti-Human IL-1β | PeproTech | 500-P21BGBT | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cell Scraper | TPP | 99002 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34557 | Cell staining solution |
| Chromafil Xtra PTFE-45/25 syringe filters | Macherey-Nagel | 729205 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment | Corning | 3471 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D-Biotin | Fluorochem | M02926 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14196-094 | |
| epT.I.P.S. Standard 2-200 µl | Eppendorf | 30000889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution | Sigma-Aldrich | 3690 | |
| EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotin | ThermoFisher | A39259 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217 |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Handy dish soap | Migros | 5.01002E+11 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| HFE-7500 Oil 3M TM Novec | Fluorochem | B40045191 | |
| Idex F-120 Fingertight One-Piece Fitting, Standard Knurl, Natural PEEK, 1/16" OD Tubing, 10-32 Coned | Cole-Parmer | GZ-02014-15 | |
| IL-6 Monoclonal Antibody (MQ2-13A5 – Rat), FITC | ThermoFisher | 11-7069-81 | |
| IL-6 Monoclonal Antibody (MQ2-39C3), Biotin | ThermoFisher | 13-7068-85 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | 10828-010 | |
| Loctite AA 3491 curable UV glue | Henkel AG & Co | 3491 | |
| Microscope slides (76x26x1mm, clear white) | Menzel Gläser | ||
| Mineral oil light | Sigma-Aldrich | 330779 | |
| NanoPort Assembly Headless, 10-32 Coned, for 1/16" OD | Idex | N-333 | |
| Neodymium block magnet | K&J Magnetics | BZX082 | |
| Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS | Braun | 9161406V | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | ThermoFisher | P6866 | |
| Precision wipes | Kimtech Science | 5511 | |
| PTFE microtubing 0.30 × 0.76 mm | FisherScientific | 1191-9445 | |
| PTFE microtubing 0.56 × 1.07 mm | FisherScientific | 1192-9445 | |
| Recombinant Human IL-1β | Peprotech | Cat#200-01B | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | Cat#200-06 | |
| Recombinant human serum albumine (HSA) | Sigma-Aldrich | A9731 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | Cat#300-01A | |
| Reusable biopsy punch diameter 0.75 mm and 6 mm | Stiefel | 504529 and 504532 | |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11835-030 | |
| Standard LPS, E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
| Sterican needles 23 G for 0.56 mm diameter microtubing | FisherScientific | 15351547 | |
| Sterican needles 27 G for 0.30mm diameter microtubing | FisherScientific | 15341557 | |
| TNF alpha Monoclonal Antibody (MAb11), PE | ThermoFisher | 12-7349-81 | |
| TNF-alpha Monoclonal Antibody (MAb1), biotinylated in-house | ThermoFisher | 14-7348-85 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99500 | |
| Devices | |||
| Cameo 4 automatic cutting machine | Silhouette | ||
| Cetoni Base 120 + 3x NEMESYS Low Pressure Syringe Pumps | Cetoni | NEM-B101-03 A | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher | ||
| Inverted Epi-fluorescence microscope Ti2 | Nikon | ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1 | |
| OKO Lab Cage Incubator, dark panels | OKO Lab | ||
| ORCA-Fusion Digital CMOS camera | Hammatsu | C14440 | |
| SOLA Light Engine | Lumencor | sola 80-10247 |
References
- Chen, L., et al. Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs. Oncotarget. 9 (6), 7204-7218 (2017).
- Cicchese, J. M., et al. Dynamic balance of pro- and anti-inflammatory signals controls disease and limits pathology. Immunol Rev. 285 (1), 147-167 (2018).
- Liu, C., et al. Cytokines: From clinical significance to quantification. Adv Sci. 8 (15), e2004433 (2021).
- Rojas, J. M., Avia, M., Martín, V., Sevilla, N. IL-10: A multifunctional cytokine in viral infections. J Immunol Res. 2017, 6104054 (2017).
- Kohanawa, Y. M. A regulatory effect of the balance between TNF-α and IL-6 in the granulomatous and inflammatory response to Rhodococcus aurantiacus infection in mice. J Immunol. 177 (1), 642-650 (2006).
- Geginat, J., et al. Plasticity of human CD4 T cell subsets. Front Immunol. 5, 630 (2014).
- Sallusto, F. Heterogeneity of human CD4+ T cells against microbes. Ann Rev Immunol. 34 (1), 317-334 (2016).
- Chetaille Nézondet, A. L., Poubelle, P. E., Pelletier, M. The evaluation of cytokines to help establish diagnosis and guide treatment of autoinflammatory and autoimmune diseases. J Leukocyte Biol. 108 (2), 647-657 (2020).
- Sims, J. T., et al. Characterization of the cytokine storm reflects hyperinflammatory endothelial dysfunction in COVID-19. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 107-111 (2021).
- Yasen, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the heterogeneity of infiltrating immune cell profiles in the hepatic cystic echinococcosis microenvironment. Infection and Immunity. 89 (12), (2021).
- Jiang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing highlights intratumor heterogeneity and intercellular network featured in adamantinomatous craniopharyngioma. Sci Adv. 9 (15), (2023).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Bucheli, O. T. M., Sigvaldadóttir, I., Eyer, K. Measuring single-cell protein secretion in immunology: Technologies, advances, and applications. Eur J Immunol. 51 (6), 1334-1347 (2021).
- Brower, K. K., et al. Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery. Lab Chip. 20 (12), 2062-2074 (2020).
- Brower, K. K., et al. Double emulsion picoreactors for high-throughput single-cell encapsulation and phenotyping via FACS. Anal Chem. 92 (19), 13262-13270 (2020).
- Luo, X., Chen, J. Y., Ataei, M., Lee, A. Microfluidic compartmentalization platforms for single cell analysis. Biosensors. 12 (2), 58 (2022).
- Bounab, Y., et al. Dynamic single-cell phenotyping of immune cells using the microfluidic platform DropMap. Nat Protoc. 15 (9), 2920-2955 (2020).
- Eyer, K., et al. Single-cell deep phenotyping of IgG-secreting cells for high-resolution immune monitoring. Nat Biotechnol. 35 (10), 977-982 (2017).
- Gaa, R., et al. Versatile and rapid microfluidics-assisted antibody discovery. mAbs. 13 (1), 198130 (2021).
- Gerard, A., et al. High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics. Nat Biotechnol. 38 (6), 715-721 (2020).
- De Jonghe, J., et al. spinDrop: a droplet microfluidic platform to maximise single-cell sequencing information content. Nat Comm. 14 (1), 4788 (2023).
- Wheeler, M. A., et al. Droplet-based forward genetic screening of astrocyte-microglia cross-talk. Science. 379 (6636), 1023-1030 (2023).
- Portmann, K., Linder, A., Oelgarth, N., Eyer, K. Single-cell deep phenotyping of cytokine release unmasks stimulation-specific biological signatures and distinct secretion dynamics. Cell Rep Meth. 3 (7), 100502 (2023).
- Portmann, K., Linder, A., Eyer, K. Stimulation-induced cytokine polyfunctionality as a dynamic concept. eLife. 12, 89781 (2023).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev. 29, S49-S52 (2008).
- Yang, J., et al. New insight into neurological degeneration: Inflammatory cytokines and blood-brain barrier. Front Mol Neurosci. 15, 1013933 (2022).
- Kim, P. S., Ahmed, R. Features of responding T cells in cancer and chronic infection. Curr Opin Immunol. 22 (2), 223-230 (2010).
- Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17 (1), 49-59 (2017).
- Cosenza, M., Sacchi, S., Pozzi, S. Cytokine release syndrome associated with T-cell-based therapies for hematological malignancies: Pathophysiology, clinical presentation, and treatment. Int J Mol Sci. 22 (14), 7652 (2021).
- Hu, B., Huang, S., Yin, L. The cytokine storm and COVID-19. J Med Virol. 93 (1), 250-256 (2021).
- Marcuzzi, A., et al. Autoinflammatory diseases and cytokine storms-Imbalances of innate and adaptative immunity. Int J Mol Sci. 22 (20), 11241 (2021).
