個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ

すべての実験は、倫理契約EK202-N-56に基づいて実施され、ETHチューリッヒの倫理委員会によって承認されました。ヒト細胞の取り扱いは、バイオセーフティレベル2の実験室に含まれる層流キャビネットで行われました。 注:次のセクションでは、単一細胞レベルで時間分解サイトカイン分泌を測定するためのプロトコルについて詳しく説明します。ここで概説する手順は、リポ多糖類(LPS)による末梢血単核細胞(PBMC)の刺激と、サイトカインIL-6、TNFα、およびIL-1βの並行測定に適用されます。ただし、必要に応じて、プロトコルを他の細胞タイプ、刺激剤、およびサイトカインに適合させることができます。 1. 観察室の製作 注:イメージング中の液滴の動きを避けるために、液滴の直径よりも約10%小さい高さの観察チャンバーが準備されています。 カッティング両面テープとトップスライドガラスの準備切断ソフトウェアの[設計]タブで、チャンバーの切り欠きの目的のデザインを描画またはロードします。ここで使用する特定のディメンションについては、 図 2E を参照してください。 厚さ32μmの両面粘着テープを粘着カッティングマットにテープで固定し、カッティングマットを自動カッティングマシンに置きます。 ステップ1.3で取り外しを容易にするために、チャンバーの長辺を同じ方向にカットするように注意しながら、テープからチャンバーデザインを切り取ります。 テープの切り欠きは室温で保管し、長期保存してください。短期保存の場合は、-20°Cで保存し、ステップ1.3の直前にのみ取り出します。取り扱いが簡単です。 1つの標準的な顕微鏡スライド(76 mm x 26 mm x 1 mm)の中央に直径約1 mmの2つの穴を開け、2つの穴の間の距離は約3.5 cmです。 スライドガラスの洗浄とプラズマ活性化穴の開いたスライドガラスと穴のないスライドガラスを石鹸で清掃します。蒸留水でよくすすぎ、糸くずの出ない精密ワイプで乾かします。 スライドガラスをプラズマクリーナーに入れ、上面を55Wで10分間プラズマ処理します。スライドガラスを取り外し、手順1.3に進みます。 チャンバー組立穴の開いたスライドガラスを、プラズマで活性化された面を上に向けて、活性化された表面に触れないように、きれいな表面に置きます。 両面粘着テープの片面から、切断と同じ方向に保護層をはがします。テープの切り欠きをスライドガラスの端とドリルで開けた穴に触れずに合わせ、テープを短辺から始めてゆっくりとスライドガラスに接触させます。注意: テープに伸びや折り目が生じないように注意してください。これにより、チャンバーの高さが正しくなくなります。このステップはエラーが発生しやすく、ある程度の実務経験が必要なため、複数のスライドガラスを並行して準備することをお勧めします。 テープから2番目の保護層を再び切断方向に取り除き、アクティブ化された表面を下に向けて穴のない2番目のスライドガラスを置きます。平らな板を上に置き、上半身の力で約10秒間押し下げて、2つのスライドガラスの全面を一緒に押します。 2つのスライドガラスを組み立てた後、2つの穴が手前を向くようにチャンバーを反転させます。ポートの下のリングに少量のUV硬化型接着剤を入れ、スライドガラスの穴の上にポートを配置して、ナノポートを2つの穴に接着します。ポートの周りにUV硬化性接着剤のリングを追加し、UVランプで接着剤を硬化させます。チャンバーは 図2Eのようになります。すぐに手順 1.4 に進みます。注意: 紫外線は目や肌に損傷を与える可能性があります。適切な保護具を着用してください。 チャンバー表面の親蛍光コーティング注:このステップは、良好なコーティング効率を確保するために、スライドガラスのプラズマ処理(ステップ1.2.2)後1時間以内に行う必要があります。フッ素系油(HFE-7500)に1%フルオロシラン溶液(1H,1H,2H,2H-パーフルオロデシルトリクロロシラン)を1mL新たに調製し、シリンジに充填します。コーティング溶液をPTFEシリンジフィルターと0.3 mm x 0.76 mm PTFEマイクロチューブに接続された27G x 0.75インチの針に通して観察チャンバーに押し込みます。 1分間のインキュベーション後、ヒュームフードの下で窒素圧を使用してコーティング溶液をチャンバーから洗い流します。別のシリンジアセンブリを使用して、チャンバーをフッ素化オイル(HFE-7500のみ)ですすいでください。 フッ素系オイルを充填したチャンバーを、入口を閉じた状態で室温(RT)で保管してください。各実験の後、細胞と液滴を直接洗い流して、コーティングが良好に保存されるようにします。注:プロトコールはここで一時停止でき、チャンバーは数ヶ月間保管して再利用できます。 マグネット付きチャンバーホルダー磁性ナノ粒子の整列のために、液滴のカプセル化およびイメージング中に観察チャンバーに静磁場を印加します。このためには、チャンバーをカスタム3Dプリント顕微鏡ホルダー( 図2D、およびBounab et al.17 補足データ4にあるファイルを参照)に入れ、チャンバーの長辺に沿って2つのネオジム磁石を保持します。 2. ナノ粒子の機能化 注:ナノ粒子の機能化のプロセスは、各サイトカインで類似していますが、唯一の違いは、サイトカイン特異的な捕捉抗体の添加です。各サイトカインの機能化は、異なる個々の反応チューブで並行して行われます。このプロトコールに先立ち、TNFα捕捉抗体とIL-1β検出抗体は、それぞれビオチンとAlexa Fluor 647で社内で標識されていました。標識は、ベンダーのウェブサイト( 材料表のリンクを参照)に記載されているメーカーのプロトコールに従って行い、抗体を分注して-20°Cで保存しました。 TNFα検出用のチューブにストレプトアビジン官能基化ナノ粒子50μL(直径(Ø)300nm)、IL-1β用50μL、IL-6用100μLを添加します。ナノ粒子溶液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1(v / v)に希釈します。 各チューブに、それぞれの容量のビオチン化捕捉抗体(ストック濃度0.5 mg/mL)を1/20(v/v)加え、室温で30分間インキュベートします。注:ナノ粒子溶液に少量を添加する場合は、チューブの上部にボリュームを堆積させ、溶液の大部分で複数回洗い流します。これにより、適切な混合が保証され、骨材の形成が防止されます。 1 mM D-ビオチン溶液の1/100(v/v)をチューブに加え、室温で5分間インキュベートします。これにより、最終的なビオチン濃度は10 μMになります。注:過剰なビオチンは、ナノ粒子上の自由結合面をブロックし、不要な凝集体の形成を減少させます。 ネオジム磁石をチューブに近づけて粒子を収集します。上清が透明になるまで待ってから、上清を捨てます。注:アッセイ全体で使用される磁石は非常に強い引力を示し、2つの磁石が誤って一緒に折れると物理的な害を及ぼす可能性があります。 ナノ粒子表面への非特異的吸着を低減するために、ナノ粒子をPluronic F-127のステップ2.1の最終体積の0.5倍(10%)およびPBSの0.5倍に直ちに再懸濁します。溶液をRTで30分間インキュベートします。 磁石を使用して粒子を収集し、上清を捨て、保存バッファーの1倍の量に再懸濁します(RPMI 1640、5%ノックアウト血清置換、1%ペン/連鎖球菌、1%組換えヒト血清アルブミン(HSA)、25 mM HEPES、0.1%プルロンF-127)。溶液をRTで30分間インキュベートします。注:ここでプロトコールを一時停止することができ、粒子は4°Cで最大1週間保存することができます。 カプセル化の直前に、ピペッティングで粒子を再懸濁し、結合したナノ粒子をIL-6:TNFα:IL-1βに対してそれぞれ2:1:1(v / v)の比率で混合します。注:官能基化ナノ粒子の異なる比率は、各サイトカインに使用される抗体ペアに依存し、最適なダイナミックレンジを得るためにキャリブレーションサンプルを通じて実験的に決定されています。 磁石で粒子を収集し、上清を捨てて再懸濁することにより、完全な培地(RPMI 1640、10S、1%ペン/溶連菌、25 mM HEPES)で洗浄します。この手順を繰り返しますが、手順 2.7 の完全なメディアの 0.5 倍のボリュームでのみ再サスペンドします。 異なる標識をしたIL-6、TNFα、およびIL-1β検出抗体を溶液に添加して、それぞれ最終濃度が10 nMになるようにします。これで、溶液を液滴実験に使用する準備が整いました。 3. 細胞調製 注:PBMCは、チューリッヒ血液銀行から受け取ったバフィーコートから分離されました。細胞を凍結し、液体窒素中のクライオバイアル(1 x 107 細胞/バイアル)に数ヶ月間保存した。 細胞の解凍実験開始の1時間前に、完全な培地とMACSバッファー(2 mM EDTA、0.5% BSAのDPBS、滅菌ろ過済み)を室温でウォームアップします。9 mLの完全培地を15 mLのチューブに加え、37°Cのウォーターバスに保持して、細胞を含むチューブを準備します。 PBMC クライオバイアル (~1 x 107 細胞を含む) を液体窒素で保存します。クライオチューブを37°Cのウォーターバスで渦巻かせ、氷が少量になるまで渦巻かせます。 チューブを70%EtOHで拭き取り、層流キャビネットに移します。1 mLの予熱済み完全培地をクライオバイアルに加え、穏やかに混合し、すべての細胞を温かい完全培地が入ったチューブに移します。クライオバイアルは、1 mLの温かい完全培地で洗浄して、最大数の細胞を回収できます。 細胞を500 x g で5分間室温で回転させ、上清を捨て、ピペットで細胞ペレットを1 mLの完全培地で穏やかに再懸濁します。9 mLの完全培地を加えます。 細胞を500 x g で5分間室温で回転させ、上清を捨て、前と同様に1 mLの完全培地に再懸濁します。 使用可能なセルカウンターを使用してセルをカウントします。この場合、自動セルカウンターが使用されました。細胞は、10 μL の細胞懸濁液と 10 μL のトリパンブルーを混合し、10 μL の混合物を細胞計数スライドに移すことにより、細胞をカウントしました。 染色とFcRブロッキング細胞の総数と、細胞を 2 x 106 生細胞/mL で再懸濁するために必要な量を計算します。細胞染色液(CellTrace Violet)をストック(5 mM)をPBS(使用濃度5 μM)で1000倍に希釈して調製します。 細胞を500 x g で5分間室温で回転させ、上清を捨て、ステップ3.2.1で調製した計算量の細胞染色溶液に細胞を再懸濁します。細胞を37°Cで5分間インキュベートします。 インキュベーションの終わりに、溶液中の残りの色素を完全な培地(染料溶液の少なくとも2倍の量)に加えて急冷します。細胞を500 x g で5分間、室温で回転させます。 上清を捨て、細胞ペレットを60 μLのMACSバッファーに再懸濁し、1 x 107 細胞あたり20 μLのヒトFcRブロックを添加します。細胞を室温で10分間インキュベートします。 チューブにMACS Bufferを10 mL充填し、細胞を500 x g で室温で5分間遠心します。 上清を捨て、細胞を1mLの完全培地に再懸濁しますステップ3.1.6で説明したように細胞をカウントします。 LPSによる細胞刺激細胞数を使用して、細胞を1 x 106 細胞/mLで希釈し、超低結合の6ウェルプレートで2 mLの細胞を各ウェルに移します。 LPSを完全な培地で希釈し、細胞を含むウェルに添加して、LPSの最終濃度を1 μg/mLにします。細胞を37°Cで6時間インキュベートします。 カプセル化の準備刺激時間の終わりに、細胞懸濁液を新しい15 mLチューブに移します。 1 mLの完全培地を空のウェルに加えます。セルスクレーパーで、残りのセルを取り外してください。細胞を新しい15 mLチューブに移します。ウェルを1 mLの完全培地で洗浄し、別の15 mLチューブに移します。 2つのチューブを500 x g で5分間室温で回転させ、1 mLの原液の上清溶液(洗浄していない細胞を含む最初のチューブから)を新しいチューブに移し、必要に応じてさらに分析します(例:ELISA)。 残りの上清を捨てます。 ペレットを0.5 mLの完全培地に再懸濁し、同じウェルの細胞を結合し、遠心チューブに移します。ステップ 3.1.6 で説明したようにセルを数えます。 細胞を500 x g で5分間室温で回転させ、上清の大部分を廃棄します(約100 μLを残します)。ペレットを再懸濁せずに、200 μLの完全培地を非常に慎重に加えます。 上清を捨てます。ステップ8.6で定義したように、6.6〜13.3×106 細胞/mLの濃度で細胞を完全培地に再懸濁し、カプセル化のための液滴当たりの平均細胞数λ=0.2〜0.4を達成します。注:ステップ3.4.6および3.4.7は、上清へのサイトカイン分泌を避けるために、カプセル化の直前に実行する必要があります。液滴あたりの細胞数はポアソン分布に従います: 、PはX個の細胞を含む液滴の割合を示し、λは液滴あたりの平均細胞数です。 4. カプセル化と液滴生成 注:液滴中の細胞のカプセル化は、マイクロ流体液滴発生器チップによって可能になるが、その製造は他の場所で非常に詳細に説明されている17。代替品は市販されています( 資料の表の例を参照)。適切な液滴発生器チップ設計には、水相用の2つの入口、油相用の1つの入口、および生成された液滴用の1つの出口があります。さらに、適切な商用液滴発生チップは、40〜60pLの体積のフッ素化油滴中の水の生成を可能にする必要があります。ここで説明するプロトコルは、直径50μmの水/油エマルジョン(液滴)をもたらします。プロトコルを変更するためにさまざまなオプションを使用すると、液滴が大きくなったり小さくなったりする可能性があります。 シリンジポンプの準備(図2A)1 mLシリンジに、HFE-7500フッ素系オイル中の2% 008-フッ素系界面活性剤からなる500 μLの連続相を入れます。27G x 0.75インチの針を0.30 mm x 0.76 mm PTFEマイクロチューブに接続し、アセンブリをシリンジに取り付け、続いてシリンジポンプに取り付けます。注意: シリンジまたはカニューレに空気が残っていないことを確認すると、流量が一定にならないため、注意してください。 水相用の2つのカスタムメイドピペットチップコネクタを準備します(図2B):Ø0.75mmの生検パンチで、Ø6mmの~5mmの高さのPDMSカットアウトの中央に穴を開けます。PDMSの切り欠きの穴から~3cmのPTFEチューブ(内径0.56mm、外径1.07mm)を引っ張り、アセンブリを200μLのピペットチップの上部に押し込みます。チューブの反対側を23Gx1.25インチの針に接続します。ピペットの上部にUV硬化型接着剤を広げてコネクタを密閉し、UV光で硬化させます。注意: 紫外線は目に有害であるため、保護のためにUVカットゴーグルを着用してください。 2つの1mLシリンジに500μLの軽質鉱物油を充填し、2本の23G針をカスタムメイドのアタッチメントで取り付け、両方をシリンジポンプに取り付けます。 シリンジポンプ制御ソフトウェアを使用して、30 μLのナノ粒子と30 μLの細胞溶液を水相のピペットチップに吸引します。 表面を水で洗浄して汚れやホコリを落とし、精密ワイプで乾燥させて観察室を用意します。2つのネオジム磁石を備えた印刷されたチャンバーホルダーにチャンバーをクランプします。注意: 磁石が正しい方向を向いている(互いに引き合う)ことを確認して、細長い骨材を形成してください。 チャンバーをわずかに傾けます(30°)。両方のポートを開き、上部ポートにペーパータオルを差し込んで、充填中に余分な外相を吸収します。 液滴製造とチャンバー充填連続相ビアチューブをマイクロ流体チップの上部インレットに接続します(図2A、C、F)。1800 μL/h の流量を使用して、連続相でチップを約 30 秒間フラッシュします。 水溶液のピペットチップを2つの中央の入口に接続します(図2A、C、F)。 それぞれ200μL / hで水溶液の流れを開始し、チャネルと出口を液体で満たします。磁性ナノ粒子を使用する場合、均質な茶赤色の溶液がチップ出口から流出するはずです。 液体が出口に現れたら、800 μL/hでフッ素化油相の流れを開始し、出口で均質な灰色の光沢のある溶液が流出することで確認され、安定した液滴生成が確立されるまで待ちます。 液滴の安定した生産が確立されたら、PTFEマイクロチューブ(内径0.3 mm x 外径0.76 mm)を出口ポートに接続して生成した液滴を回収し、マイクロチューブを指で締まったワンピース継手のフェルールモジュールに通して観察チャンバーに送ります(図2A)。 適切な液滴生成が発生した場合、均質で光沢のある液体がチャンバーを下から上にまっすぐに満たす必要があります。 チャンバーが満たされたら、流れを止め、指で締める圧力を使用してポートプラグでポートを閉じます。注意: チャンバーをきつく閉じすぎないように注意してください。空気のトラップや流入は、液滴の動きにつながり、測定中の追跡を損なう可能性があります。 液滴が生成された後、チップをフッ素化オイルで洗い流し、液体のリマインダーを窒素で吹き飛ばして、その機能を維持します。チップは何度も再利用でき、目詰まりしない限り数か月間保存できます。 図2:マイクロ流体セットアップの概要。 (A)シリンジポンプ、液滴発生チップ、観察室、顕微鏡ホルダーによる液滴封入のためのセットアップ。(B)プロトコールステップ4.1.2で説明されているように、200 μLピペットチップ(下)へのコネクタを形成するためのパンチングPDMSプラグ(上)の写真。(C)チューブとピペットチップの液滴発生チップへの接続の画像。(D)カスタム3Dプリント顕微鏡ホルダーの中に置かれたチャンバーの写真で、上部と下部に2つの磁石があります。(E)観察室の写真(図解用の白いテープ付き)。(F)液滴生成用マイクロ流体チップのレイアウト(スケールバー:750μm)。この数値は17から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5. 画像の取得と測定 注:画像取得は、インキュベーターに封入された標準的な倒立型落射蛍光顕微鏡で行われ、37°Cでの測定が可能です。 ここで説明する設定は、Orca Fusionカメラを搭載したNIS Elementsソフトウェア(V.5.30.04)で動作するNikon Eclipse Ti2顕微鏡に固有のものですが、一般的には他の蛍光顕微鏡やカメラにも適応できます。 測定パラメータの設定画像のサイズを設定するには、配列サイズとして 10 x 10 の画像を選択します。このアレイには、約50,000〜70,000個の液滴が含まれます。1%のオーバーラップを使用して、画像のステッチングのブレンドをアクティブにします。 測定チャンネル数を設定するには、細胞検出用のDAPIチャンネル、サイトカイン検出用のFITC、TRITC、Cy5チャンネル(ビーズライン)、液滴検出用のBFチャンネルを選択します。ビット深度には、2 x 2 ビットと 16 ビットのピクセル ビニングを使用します。カメラの設定を調整して、すべての蛍光チャネルでカメラの最大値に達しない液滴内強度ピクセル値を達成します。注:各チャンネルの正確な露光時間とランプ強度は、使用するモデルと試薬によって異なり、検量線を生成する前に確立されます(ステップ7)。キャリブレーションとセル測定で同じ取得設定を使用することは、正確な定量化にとって重要です。 時間分解測定を設定するには、30分ごとに合計9回の測定を行います。注:測定パラメータは、使用済み細胞、刺激剤、試薬、測定されたサイトカイン、インキュベーション温度、および顕微鏡モデルによって異なる場合があります。 測定の開始チャンバーホルダーをウェルプレートフォーマットステージ(図2D)で顕微鏡に取り付け、10倍対物レンズを使用して明視野(BF)チャンネルに切り替えます。 BFの固定化された液滴に焦点を当て、必要に応じてパンして調整することにより、アセンブリが完全な平面に取り付けられていることを確認します。後続の手順のためにチャンバーの中央に移動します。 オートフォーカスシステム(PFS)を作動させ、BFチャンネル上の最適な測定面に設定すると、液滴の端が油相や背景と簡単に区別できる黒く鋭い円として現れます。注:自動集光システムがなくても測定も可能ですが、顕微鏡に自動集光システムが装備されている場合は、それを使用することを強くお勧めします。これにより、大きくてステッチが多かった画像の測定品質が向上します。 すべての蛍光チャネルを通過し、それぞれに最適な測定面を設定します。FITC、TRITC、Cy5チャネルでの再配置測定では、ナノ粒子凝集体が完全に焦点を合わせていることを確認し、DAPIチャネルでは、細胞に焦点が合っていることを確認します。注:最適な焦点面とz値は、測定されたすべてのチャンネルで異なる場合があります。各チャンネルのPFSオフセットは必ず保存してください。 測定を開始する前に、すべてのチャネルを通過して個々の焦点を再確認し、溶液がウォームアップしている間に最初に動きが発生する可能性があるため、平衡化するために5分間待ちます。 測定を開始します。最初の画像を生成した後、不規則性(フォーカス、動く液滴、間違ったチャンネルなど)がないか確認します。必要に応じて取得を再開するか、空気の場合はチャンバーを補充します(ステップ4.1.4から開始します)。アセンブリを放置して、4時間にわたって液滴をイメージングします。 6. 画像解析 画像解析ソフトウェア(DropMap Analyzer App v 4.023)をMatLab(https://github.com/ESPCI-LCMD/MiMB)にインストールし、生成された.nd2ファイルを実験から解析コンピュータに転送します。 アプリケーションを開きます。指定された設定を選択し、それ以外の場合はデフォルト値のままにします:CH1:DAPI、WD(全液滴)が選択されています。CH2:FITC、BL(ビーズライン)が選択されています。CH3:TRITC、BLを選択。CH4:Cy5、BLが選択されました。最大液滴径(μm):70;落下検出:フル。追跡:はい。 [スタート ]ボタン(フルーツのアイコン)を押して.nd2ファイルの場所を選択し、解析を開始します。 数分後、プログラムは画像のサンプル セクションを表示します (図 3A)。飛沫検出に適したものが見つかるまで スペース を押し、 Enterキーを押します。同じ画像セクションで、液滴を検出するための閾値パラメーターを見つけるための代表的な領域に四角形を描画します。 数分後、DAPIチャネルの強度分布を示す別のウィンドウが開きます。スライダをドラッグ&ドロップして、染色した細胞からのシグナルのみを検出し、右上の 「Done 」をクリックします。 画像を [Max. Drop Diameter (μm)] (最大液滴径 (μm) よりも小さい直径の 1 つの液滴にセグメント化した後、プログラムはユーザー入力なしで各液滴、タイムポイント、および蛍光チャネルに対して次の手順を実行します ( 図 3 を参照)。ソフトウェアは、時間点間で移動した液滴のピクセルを計算します(40ピクセルを超えて移動する液滴は自動的に除外されます)。 このソフトウェアは、液滴全体の平均蛍光値を測定し、水平線上の最も明るいピクセルを見つけ、液滴の上から下までの垂直線上のすべてのピクセル強度を平均することにより、平均ビーズライン強度を検出および測定します。これは自動的に行われ、次の式に従って平均ビードライン再配置値(図3B)を計算するために使用されます(図3B)。 ソフトウェアは、DAPIチャネルで設定されたしきい値を超える液滴領域の合計ピクセルの割合を計算します。 結果の .xslx ファイルには、さらに分析するための次の列が含まれます: DropIdX (経時的に追跡された液滴の ID)、TrueCentroid_ t*2-1 および t+2 (それぞれ、時間点 t の液滴中心の x 座標と y 座標)、DiameterMicrons (液滴の直径 (μm)、TrackingMove (測定時間全体で移動したピクセル数)、FluoChannel_BL_Ratio_t (時間点 t での FluoChannel の再配置値)、 DAPI_WD_PosPxlCount_t(時点tにおけるDAPIチャネルの液滴全体の中でしきい値を超えるピクセル数)。 図3:画像解析ソフトウェアによって実行される画像解析 (A)液滴は、ハフ変換を使用して明視野(BF)チャネルで検出され、各液滴に赤い円でマークされます。スケールバー:200μm.(B)各液滴内では、水平面内の最も明るいピクセルと、液滴の上から下まで広がるすべてのピクセルの平均蛍光強度を通じて、ナノ粒子ビーズラインが識別されます。さらに、セルは、液滴領域全体に対してしきい値を超えるピクセルパーセンテージ>0によって識別されます。スケールバー:20 μm. (C) 分析ソフトウェアは、個々の液滴について、測定されたすべての時間点について、ナノ粒子の蛍光強度をFITC、TRITC、Cy5チャンネルの液滴バックグラウンドと比較します。表示されているのは、タイムポイント0、4(120分)、9(240分)です。正しいドロップレットとセルの検出を手動で確認するために、DAPIチャネルとBFチャネルも表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 7. キャリブレーション 注:定量的な読み出しのためには、異なる実験設定間で違いが生じる可能性があるため、サイトカイン濃度と蛍光再配置値へのキャリブレーションを一度実行する必要があります。必要なすべての手順については、参照された前のプロトコル セクションで詳しく説明しています。 ステップ2で説明したようにナノ粒子を調製します。 ヒトIL-6、TNFα、IL-1β組換えタンパク質をメーカーの指示に従って再構成します。注意: 冷凍アリコートは一度だけ解凍し、すぐに使用するようにしてください。 開始濃度が 80 nM から 0.625 nM までの完全な培地(10% FBS、1% Pen/Strep、25 mM HEPES)を使用して、3 つのタンパク質すべての 2 倍希釈シリーズを一緒に調製します。 ステップ4で説明したように、第1の官能基ナノ粒子を、第2の水相のみをRPMIでカプセル化します。この測定値はブランクとして機能し、測定された標準偏差は後でデータ分析に使用されます。 5 分間待ってから、手順 5 の説明に従って液滴を画像化します。アレイサイズが2 x 2のそれぞれの蛍光チャンネルで3枚の画像を撮影します。 準備したすべてのキャリブレーション溶液について、ステップ7.4と7.5を、最も低い濃度から最高濃度まで繰り返します。 ステップ 6 の説明に従ってイメージを分析します。DAPIチャネルにWDオプションを使用せず、[トラッキング]を[いいえ]に設定してください。 この解析では、1つの画像で測定されたすべての液滴の蛍光再配置値が出力されます。すべての蛍光チャネルの中央値と標準偏差を抽出します。濃度ごとに測定されたすべての画像の中央値と標準偏差を平均化します。 各組換えタンパク質の測定濃度に対して平均中央値再配置をプロットすることにより、検量線を生成します。 1 相の関連付けを使用して曲線をフィットします: 、Y = x での再配置、Y0 = ブランク測定値の再配置、x は使用濃度です。得られた検量線は、ステップ8で説明したように、再配置値を定量化するために使用されます。注意: 測定された最高移動までの値のみに適合し、測定された移動が少ない高濃度からの値を除外します。高濃度での測定された再配置値の減少が予想され、フック効果とナノ粒子の結合能力の制限により発生します。 8. データ分析 TrackingMove 値が 10 より大きい、つまり測定の時間経過で 10 ピクセル以上移動した液滴を除外します。 最初の時点で染色細胞を含む液滴(DAPIチャネル)を同定するには、列DAPI_WD_PosPxlPercent_1で0より大きい値の液滴をソーティングします。 各蛍光チャネル(FluoChannel_BL_Ratio_tカラム)の蛍光再配置に以下の3つの基準を適用することにより、分泌細胞を含む液滴を同定します。リロケーション値が増加する液滴を、測定時間にわたって正の傾きでソートすることにより、特定します。 再配置値が検出限界(LOD)に達している液滴を特定します。液滴は、測定時間にわたる最大蛍光再配置がLODよりも優れている場合に選択され、他の場所で説明したように計算されます25:、ここで、μ再配置t0は、時間点0およびσBLK におけるすべての再配置値の中央値であり、BLKはキャリブレーション中に測定されたブランクの標準偏差であり、それぞれがサイトカイン特異的です。 測定時間中の最大測定蛍光再配置と最小蛍光再配置の間の変化が以下よりも優れていることを確認することにより、再配置値の増加が有意であることを確認する 。 ステップ8.3で説明した基準を満たすことにより、共分泌細胞を同定します。同時に複数の蛍光チャネル用。 手順8.3を繰り返します。セルを含まないすべての液滴 (DAPI_WD_PosPxlPercent_1 = 0) に対して。これらのドロップレットを使用して、誤検出の割合を計算します。 200〜500個の液滴をランダムに選択し、画像解析ソフトウェアの検証およびソート機能でそれらを検査することにより、測定値の正確なλ値を決定します。これらの液滴中の細胞の数を数え、次のように計算します。λ = カウントされた細胞の数 / 解析された液滴の数 測定用のカプセル化されたセルの総数を次のように計算します。総細胞数 = λ × 解析した液滴の数 決定された細胞数を使用して、分泌細胞の割合を計算します。さらに、各サイトカインの偽陽性率(通常、チャネルあたりの実際の陽性数に対して3%〜5%未満)を計算し、実験の一貫性と再現性の内部コントロールとして使用します。 分泌サイトカイン濃度を計算するには、ステップ7.10で確立されたキャリブレーション方程式を使用して、再配置値を濃度に変換します。 次の式を使用して、時点間の分泌率(SR)を計算します。 時間ポイント間の個々の分泌速度を平均することにより、測定値全体の平均分泌速度を計算します。測定が終了する前に最大測定可能再配置に達した場合は、濃度を最大測定可能濃度(この値はサイトカイン固有であり、ステップ6.10の検量線で測定および使用された最大濃度に対応します)に設定し、それ以上の濃度を計算しないでください。分泌率を計算し、この時点までの平均のみを計算します。注:1つの蛍光チャネルで検出される分泌細胞が50個未満の場合、液滴は検証およびソート機能を通じて視覚的に検査する必要があり、蛍光またはナノ粒子凝集体を有する液滴は分析から除外できます。 各単一細胞の分泌曲線からさらにパラメーターを抽出するには、カスタムPythonスクリプト(ご要望に応じて利用可能)を使用して、各細胞およびサイトカインの時間-濃度曲線に最小二乗近似を実行します。フィット関数は、以下で説明する式に従うシグモイド曲線です(R2<0.95のフィットは次の手順から除外されます)。ここで、Cは濃度プラトー[nM]、t50 は半値[s]のシフト、mはヒルスロープ[min-1]に対応します。これらのパラメータから、以下で説明するように、次のカーブ記述子が抽出されます。Cmax [nM]:最大測定濃度。 :分泌開始の時間、フィット感はCの10%に達する。 :時間-濃度曲線の10%から90%の間の曲線の近似線形傾きとしての分泌率。