Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana
Summary
Este protocolo descreve um ensaio para quantificar a taxa de alimentação de Caenorhabditis elegans com base na medição da depuração de bactérias em cultura líquida.
Abstract
A alimentação é um processo biológico essencial para o crescimento, reprodução e sobrevivência de um organismo. Este ensaio tem como objetivo medir a ingestão alimentar de Caenorhabditis elegans (C. elegans), um parâmetro importante no estudo da genética do envelhecimento ou metabolismo. Na maioria das espécies, a alimentação é determinada medindo a diferença entre a quantidade de alimento fornecida e a quantidade restante após um determinado intervalo de tempo. O método aqui apresentado utiliza a mesma estratégia para determinar a alimentação de C. elegans. Ele mede a quantidade de bactérias, a fonte de alimento de C. elegans, eliminadas em 72 h. Este método usa placas de microtitulação de 96 poços e permitiu a triagem de centenas de medicamentos por sua capacidade de modular a ingestão de alimentos a uma velocidade e profundidade não possíveis em outros modelos animais. A força deste ensaio é que ele permite medir a alimentação e a expectativa de vida simultaneamente e mede diretamente o desaparecimento de alimentos e, portanto, é baseado nos mesmos princípios usados para outros organismos, facilitando a comparação de espécie para espécie.
Introduction
Caenorhabditis elegans tem sido amplamente utilizado na pesquisa do envelhecimento. Tem sido um modelo poderoso para estudar a genética subjacente à longevidade mediada pelo metabolismo induzida por restrição alimentar, atividade mitocondrial reduzida ou sinalização de insulina reduzida. 1,2,3,4,5,6,7. No entanto, medir a alimentação no contexto da longevidade tem se mostrado difícil para C. elegans devido ao pequeno tamanho do animal 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
A alimentação é um comportamento biológico fundamental necessário para a sobrevivência, e sua regulação rígida está no centro da manutenção da saúde metabólica, reprodução e envelhecimento. O comportamento alimentar é controlado por múltiplas vias de sinalização tanto no sistema nervoso quanto na periferia e, portanto, só pode ser estudado in vivo 16,17,18,19. A alimentação representa o primeiro de três pilares: (i) ingestão de energia, (ii) armazenamento de energia e (iii) gasto de energia que governa a homeostase energética de um organismo. A alimentação em C. elegans foi investigada principalmente pela medição do bombeamento faríngeo, definido pela taxa de contrações da faringe. Essa abordagem forneceu informações cruciais sobre o comportamento alimentar de C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; no entanto, o bombeamento faríngeo, especialmente medido em curtos intervalos de minutos, não está necessariamente correlacionado com a ingestão de alimentos.
A ingestão de alimentos não é determinada apenas pela taxa de bombeamento faríngeo, mas também por parâmetros como duração e frequência das sessões de alimentação e a densidade das bactérias alimentares. Um animal pode ter um bombeamento faríngeo muito alto, mas a duração de suas sessões de alimentação pode ser menor, compensando o aumento da taxa. Outro fator de confusão é a eficiência pela qual o bombeamento pode ou não ingerir e triturar bactérias. Um exemplo extremo de desacoplamento da ingestão de alimentos do bombeamento faríngeo é a adição de serotonina sem a presença de qualquer alimento (bactéria). Na presença de serotonina exógena, os animais bombeiam em alta taxa, mas sem a presença de bactérias, a alta taxa de bombeamento não leva à ingestão de alimentos 2,6,13,22,23.
O método de depuração bacteriana apresentado aqui mede a ingestão de alimentos das populações de vermes em poços individuais como o declínio das concentrações bacterianas ao longo do tempo (Figura 1). Essa abordagem é semelhante àquelas utilizadas em outras espécies, onde o desaparecimento de alimentos representa uma medida da ingestão alimentar 10,11,24,25,26,27,28. Na publicação original, validamos esse método de medição da ingestão alimentar alimentando C. elegans com bactérias marcadas com isótopos 15N11. Medições subsequentes por espectrometria de massa mostraram que a medição do desaparecimento de bactérias se correlacionou fortemente com a ocorrência de marcação de isótopos, revelando a absorção real da bactéria no animal11. Assim, estamos confiantes de que o ensaio de depuração bacteriana representa a ingestão de alimentos na maioria das circunstâncias. O objetivo do ensaio não é substituir o ensaio de bombeamento faríngeo, mas adicionar à caixa de ferramentas de ensaios para estudar a alimentação e o metabolismo em C. elegans e como isso se relaciona com o envelhecimento e a longevidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado mede a depuração bacteriana como uma leitura da ingestão alimentar de C. elegans em placas de microtitulação de 96 poços. As curvas dose-resposta na seção de resultados representativos mostram que o ensaio mede quantitativamente a ingestão de alimentos, uma noção que foi confirmada independentemente usando bactérias marcadas com isótopos11. Usando este ensaio, testamos com sucesso medicamentos aprovados pela FDA, como antipsicóticos, com efeitos colaterais metabólicos humanos conhecidos e mostramos que esses medicamentos aumentaram a alimentação em C. elegans10,26. O ensaio é útil para estudar a genética ou farmacologia da alimentação e adiciona uma nova ferramenta para a pesquisa de C. elegans para estudar o metabolismo. Este ensaio fornece um método de baixo custo para estudar a alimentação de maneira escalável e econômica, o que não é possível na maioria dos outros organismos. Nosso trabalho com medicamentos aprovados pela FDA mostra que muitos efeitos colaterais observados em pacientes humanos também são observados em C. elegans, revelando conservação evolutiva 24,26,32.
O ensaio é limitado pela concentração de bactérias que podem ser medidas dentro da faixa linear da medição OD600 . Como resultado, o número de vermes e a faixa de concentrações bacterianas que podem ser analisadas são limitados. Muitos vermes afetarão o OD600 consumindo as bactérias muito rapidamente, portanto, “comendo” a concentração bacteriana do OD600 linear. Em nossa experiência, a variabilidade na preparação bacteriana é o parâmetro crítico que faz com que os resultados variem de um experimento para outro. Tentamos, sem sucesso, congelar grandes lotes de bactérias ou usar bactérias liofilizadas. Nesses casos, a taxa de autólise tornou-se muito alta ou as bactérias eram de uma qualidade que retardou o desenvolvimento de C. elegans . No entanto, nossos testes não foram exaustivos e esse problema pode ser solucionável.
Em geral, a taxa de autólise das bactérias é a mais difícil de controlar e pode causar uma variabilidade considerável. Descobrimos que alguns medicamentos podem aumentar a taxa de autólise a níveis que o ensaio não pôde determinar com segurança a ingestão de alimentos. Como a taxa de autólise aumenta com o tempo no ensaio, não medimos a ingestão de alimentos além do dia 5 da idade adulta. Nessa idade, as bactérias estão ~ 10 dias em cultura. Para medir a ingestão de alimentos após o 5º dia da idade adulta, as bactérias velhas devem ser lavadas e substituídas por novas.
O ensaio apresentado é uma extensão do nosso ensaio de vida útil baseado em placas de microtitulação de 96 poços31. Essa combinação permite medir a expectativa de vida e a ingestão de alimentos na mesma população. Embora o ensaio de depuração bacteriana aqui apresentado não permita determinar a ingestão de alimentos ao longo de toda a vida de C. elegans devido à autólise bacteriana, ele fornece dados sólidos para os primeiros quatro dias da idade adulta, o momento com maior ingestão de alimentos. Especialmente para a descoberta de medicamentos de moléculas pequenas, o controle da ingestão de alimentos é essencial. Em resumo, prevemos que o ensaio apresentado será útil para a comunidade de C. elegans e expandirá o conjunto de ferramentas para estudar o metabolismo ou controlá-lo no contexto de estudos de envelhecimento e expectativa de vida.
Planeamento:
Antes de planejar a medição da ingestão de alimentos, algumas considerações devem ser feitas.
Matando as bactérias:
Matamos bactérias por irradiação com raios-X em um tubo cônico de 50 mL (900 Gray por 4 h definido em 160,0 kV e 25,0 mA). Usamos o RS2000 da Rad Source para a irradiação. Dependendo do equipamento, o tempo específico e a dose de radiação podem variar de instalação para instalação. A morte completa da bactéria precisa ser determinada por plaqueamento da bactéria após a irradiação para detectar sobreviventes pelo crescimento. É essencial matar todas as bactérias para evitar o crescimento durante o ensaio, pois isso causará uma subestimação da alimentação ou mesmo valores negativos de alimentação. É importante ressaltar que as bactérias devem ser mortas para que C. elegans ainda as coma. Em nossa experiência, existem três maneiras de matar grandes quantidades de bactérias de forma confiável: (i) irradiação por raios-X, (ii) por raios-γ e (iii) adição de formaldeído29,30. As taxas de autólise entre esses três métodos são comparáveis, com um coeficiente de variação de 8% entre as taxas de autólise para os experimentos mostrados na Figura 3B. Os métodos que não funcionaram de forma confiável em nossas mãos foram irradiação UV, coquetéis antibióticos, inativação por calor e azida sódica. Esses métodos não conseguem matar completamente as bactérias (UV e antibióticos), produzem bactérias que C. elegans não come (calor) ou alteram a ingestão de alimentos (azida sódica).
Número de réplicas:
Em nossa experiência, as mudanças de dobra na alimentação são geralmente pequenas em comparação com a variação observada. Assim, medir as mudanças na ingestão de alimentos requer vários poços replicados. A Figura 2A, B mostra placas de 96 poços projetadas para quatro ou seis condições diferentes, com 21 ou 14 poços replicados e dois poços de controle de autólise sem vermes. Dada a grande variabilidade e as mudanças relativamente pequenas a serem esperadas, mudanças de 0,5 a 2,5 vezes na alimentação tendem a ser os limites inferior e superior. Recomendamos 14 a 21 poços replicados para cada condição e pelo menos dois poços de controle de autólise, descritos a seguir. Essas repetições são suficientes para gerar curvas quantitativas de dose-resposta para drogas que alteram a alimentação11,26.
Controles de autólise:
O OD600 mede o número de partículas em uma solução, principalmente independente do tamanho da partícula. No entanto, as bactérias mortas se lisarão, perdendo sua natureza de partícula. Chamamos isso de selflysis, que acontece independentemente na presença de vermes e reduz as medições de OD600 sem que os vermes comam. A autólise acontece durante o ensaio e precisa ser medida independentemente em pelo menos dois poços por condição. Esses poços recebem o mesmo tratamento que os outros dentro da mesma condição, exceto que não contêm vermes. Descobrimos que muitos medicamentos também podem alterar a taxa de autólise. Assim, cada condição necessita de poços de controle de autólise independentes com sua respectiva concentração. A Figura 2 mostra uma configuração de placa para quatro ou seis condições com todos os poços de controle de autólise na parte inferior da placa na linha H.
N2 população de referência:
Também observamos que a quantidade absoluta de bactérias consumidas pode flutuar entre os experimentos, provavelmente relacionada à qualidade das bactérias. Apesar de nossos melhores esforços para prepará-los exatamente da mesma maneira todas as vezes, há flutuações. Por exemplo, as bactérias podem ser colhidas enquanto estão em um estado de divisão durante a fase de crescimento logarítmico e, portanto, ser muito maiores em tamanho do que as bactérias colhidas na fase estacionária. Portanto, essas diferenças simples no tamanho da bactéria podem levar a mudanças no número de bactérias consumidas e diferentes valores de OD600 , uma vez que as medições de OD600 não distinguem entre tamanhos. Por esse motivo, sempre incluímos uma população de animais de controle N2 não tratados que servem como valor de referência, definido como 1 ou 100%, para determinar se os grupos experimentais comem mais ou menos do que o controle N2. Essa prática permite comparações entre experimentos, mesmo que os valores de OD600 variem.
Intervalos de tempo:
O uso de valores OD600 para medir a ingestão de alimentos requer que a concentração bacteriana diminua de forma mensurável. Como o volume da cultura é muito maior do que o dos vermes, eles devem comer uma quantidade significativa de bactérias para fazer uma diferença detectável. Permanecer na faixa linear para valores de OD600 requer que a concentração bacteriana permaneça entre ~ 1 mg / mL e 10 mg / mL, de modo que uma quantidade considerável de bactérias deve desaparecer para detectá-la. Os vermes comem mais do final do L4 ao dia 4 da idade adulta por causa da produção de ovos. Assim, esse intervalo é ideal. Intervalos mais curtos, como 24 h, podem ser medidos11, mas isso é consideravelmente mais difícil e precisa de ~ 40 poços por condição. Outra opção para medir a ingestão alimentar das larvas é dobrar o número de animais por poço. No entanto, o problema com essa abordagem é que muitos vermes começarão a afetar as leituras do OD600 quando crescerem.
Soluções de estoque para medicamentos a serem testados:
Se drogas como a serotonina forem testadas quanto à sua capacidade de modular a alimentação, considere o seguinte ao preparar soluções de estoque. Geralmente preparamos um estoque de 50x para medicamentos solúveis em água e adicionamos 3 μL a cada poço (1:50), mas outras concentrações de estoque (100x, 300x) também funcionam. No entanto, se os medicamentos forem diluídos em solventes diferentes da água (por exemplo, DMSO), a concentração final não deve exceder 0,5%. Os solventes rapidamente se tornam prejudiciais ao C. elegans. Assim, as soluções de estoque de medicamentos dissolvidos em solventes orgânicos, como o DMSO, devem ser 300x ou mais.
Pontuação de vermes vivos e mortos:
A determinação de animais vivos e mortos é baseada no movimento do verme. A luz forte, especialmente a luz azul, é usada porque faz com que os animais se movam. Além disso, pontuar o número de animais por poço revelará se há excesso de mortes. O excesso de mortes pode ocorrer com substâncias tóxicas ou altas concentrações (>0,5%) de vários solventes, incluindo DMSO. Geralmente, deve haver menos de 1:100 (1%) animais mortos. As placas podem ser agitadas por 30 s a 800 rpm no agitador de placas de microtitulação se a comida assentar e a população se tornar difícil de contar. Ignore poços com machos ou mais de 16 vermes (ver problemas).
Problemas potenciais:
Agitação inadequada:
Em um meio líquido, as bactérias podem facilmente se aglomerar e se estabelecer no fundo dos poços. Em nossa experiência, agitar por menos de 20 minutos pode não conseguir quebrar os aglomerados bacterianos e ressuspendê-los, causando medições imprecisas de OD600 . As medições de OD600 na presença de aglomerados bacterianos subestimarão a concentração bacteriana. Configurações excessivas do agitador podem fazer com que o líquido fique preso ao selador. Uma vez que o selador é removido para a leitura OD600 , o líquido preso ao selador resultará em uma leitura OD600 mais baixa. Se houver líquido no selador, gire rapidamente a placa em velocidade baixa (500-1.000 rpm) e agite novamente por 5 min. Além disso, certifique-se, conforme indicado para as leituras no Dia 1 e no Dia 4, de ler dentro de 10 minutos após agitar as placas para evitar que as bactérias se acalmem.
Diferentes valores absolutos de ingestão alimentar entre experimentos:
Apesar de nossos melhores esforços para padronizar as preparações bacterianas, elas geralmente diferem de maneiras que afetam a ingestão de alimentos em vermes. Por exemplo, devido ao seu estado de divisão, as bactérias diferem em tamanho com base no fato de terem sido colhidas no crescimento logarítmico ou na fase estacionária, com as bactérias logarítmicas sendo maiores. Devido às medições do OD600 não distinguirem entre os tamanhos, as diferenças no tamanho bacteriano devido à fase em que a bactéria foi colhida podem levar às diferenças aparentes observadas na ingestão alimentar basal entre as preparações bacterianas. A melhor maneira de comparar entre experimentos é sempre incluir uma população de controle N2 não tratada e normalizar os resultados para essa população N2.
Efeitos de aglomeração:
A concentração bacteriana neste protocolo é suficiente para manter o OD600 na faixa linear para 2-16 vermes por poço por ~ 72 h. Dependendo do medicamento de interesse, um poço contendo mais de 16 vermes pode esgotar a concentração bacteriana antes da segunda medição. Também descobrimos que poços com um animal tendem a não ser confiáveis. O fator de lise supera o que um único verme come. Assim, pequenos erros na determinação do fator de lise afetam desproporcionalmente os poços com menos vermes.
Recomendamos excluir poços das análises estatísticas se uma das condições abaixo for atendida. Há machos no poço (não temos dados comparando a ingestão de alimentos entre machos e hermafroditas); há menos de 2 vermes no poço ou mais de 16 vermes no poço; vermes estão mortos na segunda leitura; ou se houver progênie nos poços porque o FUdR falhou. O FUdR é sensível ao calor e é inativado mesmo por temperaturas tão baixas quanto 37 °C. Sempre descongele o FUdR em água em temperatura ambiente.
Valores negativos de ingestão alimentar:
Os valores de ingestão de alimentos são ocasionalmente negativos, sugerindo mais alimentos no Dia 4 do que no Dia 1. Valores negativos de ingestão alimentar podem indicar um dos seguintes fatores: alta taxa de autólise , possivelmente causada por uma adição de fármaco que atua sobre a bactéria, ou valores negativos de ingestão alimentar, o que pode sugerir que o poço está contaminado e algo diferente de vermes está crescendo. As taxas de autólise também aumentam à medida que as bactérias envelhecem; portanto, recomendamos o uso de bactérias com no máximo uma semana. Um medicamento que precipita com o tempo foi adicionado, afetando o valor OD600 . Agitação insuficiente no Dia 1 pode levar a uma leitura de OD600 mais baixa devido a aglomerados bacterianos. Os vermes sofreram estresse hipóxico. Isso ocorre quando a relação superfície-ar não é suficiente para permitir a troca de oxigênio. Use a placa específica de 96 poços nos materiais e não exceda 150 μL (120 μL + 30 μL de FUdR) por poço. A distância entre a superfície do poço e o fundo onde vivem os vermes determina a concentração de oxigênio.
Limitações:
Este ensaio é limitado à cultura líquida. Os comportamentos alimentares observados em pratos sólidos, como entrar e sair de gramados de alimentos, não podem ser avaliados com o ensaio.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a Xiaolan Ye, pois este protocolo foi desenvolvido como resultado de uma observação que ela fez originalmente. Agradecemos a todos os membros anteriores e atuais do Petrascheck Lab por sua ajuda no desenvolvimento e otimização deste protocolo. Este trabalho foi financiado pela R21 AG080376 (para M.P.). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa do NIH (P40 OD010440).
Materials
| Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
| Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
| Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
| M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave |
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| Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
| Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
| Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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| Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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| S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C |
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| S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 |
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| Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
| Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
| Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
| Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |
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