Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.
Voeding is een essentieel biologisch proces voor de groei, voortplanting en overleving van een organisme. Deze test heeft tot doel de voedselinname van Caenorhabditis elegans (C. elegans) te meten, een belangrijke parameter bij het bestuderen van de genetica van veroudering of metabolisme. Bij de meeste soorten wordt de voeding bepaald door het verschil te meten tussen de hoeveelheid voedsel die wordt verstrekt en de hoeveelheid die overblijft na een bepaald tijdsinterval. De hier gepresenteerde methode gebruikt dezelfde strategie om de voeding van C. elegans te bepalen. Het meet de hoeveelheid bacteriën, de voedselbron van C. elegans, die binnen 72 uur is opgeruimd. Deze methode maakt gebruik van microtiterplaten met 96 putjes en heeft het mogelijk gemaakt om honderden geneesmiddelen te screenen op hun vermogen om de voedselinname te moduleren met een snelheid en diepte die in andere diermodellen niet mogelijk is. De kracht van deze test is dat het mogelijk is om voeding en levensduur tegelijkertijd te meten en direct het verdwijnen van voedsel te meten en dus gebaseerd is op dezelfde principes die worden gebruikt voor andere organismen, waardoor vergelijking tussen soorten mogelijk wordt.
Caenorhabditis elegans is op grote schaal gebruikt in verouderingsonderzoek. Het is een krachtig model geweest om de genetica te bestuderen die ten grondslag ligt aan een door metabolisme gemedieerde levensduur die wordt veroorzaakt door dieetbeperking, verminderde mitochondriale activiteit of verminderde insulinesignalering. 1,2,3,4,5,6,7. Het meten van voeding in de context van een lang leven is echter moeilijk gebleken voor C. elegans vanwege de kleine omvang van het dier 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
Voeding is een fundamenteel biologisch gedrag dat nodig is om te overleven, en de strikte regulering ervan vormt de kern van het behoud van metabole gezondheid, voortplanting en veroudering. Voedingsgedrag wordt gecontroleerd door meerdere signaalroutes in zowel het zenuwstelsel als de periferie en kan dus alleen in vivo worden bestudeerd 16,17,18,19. Voeding vertegenwoordigt de eerste van drie pijlers: (i) energie-inname, (ii) energieopslag en (iii) energieverbruik dat de energiehomeostase van een organisme regelt. De voeding van C. elegans is voornamelijk onderzocht door het meten van de keelholtepomp, zoals gedefinieerd door de snelheid van samentrekkingen van de keelholte. Deze aanpak heeft cruciale inzichten opgeleverd in het voedingsgedrag van C. elegans: 3,4,8,12,13,20,21; Faryngeaal pompen, vooral gemeten over korte intervallen van minuten, is echter niet noodzakelijkerwijs gecorreleerd met voedselinname.
De voedselopname wordt niet alleen bepaald door de pompsnelheid van de keelholte, maar ook door parameters zoals de duur en frequentie van de voedingsperioden en de dichtheid van voedselbacteriën. Een dier kan een zeer hoge faryngeale pomping hebben, maar de lengte van zijn voedingsperioden kan korter zijn, wat de verhoogde snelheid compenseert. Een andere verstorende factor is de efficiëntie waarmee bacteriën al dan niet worden opgenomen en vermalen. Een extreem voorbeeld van het loskoppelen van voedselinname van faryngeaal pompen is de toevoeging van serotonine zonder dat er voedsel(bacteriën) aanwezig zijn. In aanwezigheid van exogene serotonine pompen dieren met een hoge snelheid, maar zonder aanwezigheid van bacteriën leidt de hoge pompsnelheid niet tot voedselinname 2,6,13,22,23.
De hier gepresenteerde bacteriële klaringsmethode meet de voedselopname van wormpopulaties in individuele putten als de afname van bacterieconcentraties in de loop van de tijd (Figuur 1). Deze benadering is vergelijkbaar met die welke wordt gebruikt bij andere soorten waar het verdwijnen van voedsel een maat is voor de voedselinname 10,11,24,25,26,27,28. In de oorspronkelijke publicatie hebben we deze methode voor het meten van voedselinname gevalideerd door C. elegans te voeden met 15N-isotoop-gelabelde bacteriën11. Latere metingen door middel van massaspectrometrie toonden aan dat het meten van het verdwijnen van bacteriën sterk correleerde met het optreden van isotopenlabeling, waardoor de daadwerkelijke opname van de bacteriën in het dier werd onthuld11. We zijn er dus van overtuigd dat de bacteriële klaringstest in de meeste omstandigheden de voedselinname vertegenwoordigt. Het doel van de test is niet om de faryngeale pomptest te vervangen, maar om toe te voegen aan de gereedschapskist van assays om voeding en metabolisme in C. elegans te bestuderen en hoe dit zich verhoudt tot veroudering en een lang leven.
Het gepresenteerde protocol meet de bacteriële klaring als een uitlezing voor de voedselinname van C. elegans in microtiterplaten met 96 putjes. De dosis-responscurves in de sectie representatieve resultaten laten zien dat de test de voedselinname kwantitatief meet, een idee dat onafhankelijk werd bevestigd met behulp van isotoop-gelabelde bacteriën11. Met behulp van deze test hebben we met succes door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen getest, zoals antipsychotica, met bekende menselijke metabole bijwerkingen en toonden we aan dat deze geneesmiddelen de voeding in C. elegansverhoogden 10,26. De test is nuttig om de genetica of farmacologie van voeding te bestuderen en voegt een nieuw hulpmiddel toe voor C. elegans-onderzoek om het metabolisme te bestuderen. Deze test biedt een goedkope methode om voeding op een schaalbare en tijdvriendelijke manier te bestuderen, wat in de meeste andere organismen niet mogelijk is. Ons werk aan door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen toont aan dat veel bijwerkingen die bij menselijke patiënten worden gezien, ook worden waargenomen bij C. elegans, wat evolutionair behoud onthult 24,26,32.
De test wordt beperkt door de concentratie bacteriën die binnen het lineaire bereik van de OD600-meting kan worden gemeten. Als gevolg hiervan is het aantal wormen en het bereik van bacterieconcentraties dat kan worden getest beperkt. Te veel wormen zullen OD600 beïnvloeden door de bacteriën te snel te consumeren, waardoor de bacterieconcentratie uit de lineaire OD600 wordt “gegeten”. In onze ervaring is variabiliteit in bacteriële bereiding de kritische parameter die ervoor zorgt dat de resultaten variëren van het ene experiment tot het andere. We hebben tevergeefs geprobeerd om grote partijen bacteriën in te vriezen of om gevriesdroogde bacteriën te gebruiken. In deze gevallen werd het zelflysepercentage te hoog, of waren de bacteriën van een kwaliteit die de ontwikkeling van C. elegans vertraagde. Onze tests zijn echter niet uitputtend geweest en dit probleem kan mogelijk worden opgelost.
Over het algemeen is de zelflysesnelheid van de bacteriën het meest uitdagend om te beheersen en kan het aanzienlijke variabiliteit veroorzaken. We ontdekten dat sommige medicijnen de zelflysesnelheid kunnen verhogen tot niveaus die de test niet betrouwbaar kon bepalen voedselinname. Omdat de zelflysesnelheid in de loop van de tijd toeneemt in de test, hebben we de voedselinname niet gemeten na dag 5 van de volwassenheid. Tegen die leeftijd zijn de bacteriën ~10 dagen in cultuur. Om de voedselinname na dag 5 van de volwassenheid te meten, moeten de oude bacteriën worden afgewassen en vervangen door nieuwe.
De gepresenteerde test is een uitbreiding van onze op 96-well microtiterplaten gebaseerde levensduurtest31. Deze combinatie maakt het mogelijk om de levensduur en voedselinname in dezelfde populatie te meten. Hoewel de hier gepresenteerde bacteriële klaringstest het niet mogelijk maakt om de voedselinname gedurende het hele leven van C. elegans te bepalen als gevolg van bacteriële zelflyse, levert het solide gegevens op voor de eerste vier dagen van de volwassenheid, de tijd met de hoogste voedselinname. Vooral voor de ontdekking van geneesmiddelen met kleine moleculen is controle op voedselinname essentieel. Samenvattend verwachten we dat de gepresenteerde test nuttig zal zijn voor de C. elegans-gemeenschap en de toolset zal uitbreiden om het metabolisme te bestuderen of te beheersen in de context van verouderings- en levensduurstudies.
Planning:
Voordat u van plan bent de voedselinname te meten, moeten u een paar overwegingen maken.
Het doden van de bacteriën:
We doden bacteriën door bestraling met röntgenstralen in een conische buis van 50 ml (900 grijs gedurende 4 uur ingesteld op 160,0 kV en 25,0 mA). Voor de bestraling gebruiken we de RS2000 van Rad Source. Afhankelijk van de apparatuur kunnen de specifieke tijd en stralingsdosis variëren van faciliteit tot faciliteit. De volledige doding van de bacteriën moet worden bepaald door de bacteriën na bestraling te plateren om overlevenden door groei te detecteren. Het is essentieel om alle bacteriën te doden om groei tijdens de test te voorkomen, omdat dit een onderschatting van de voeding of zelfs negatieve voedingswaarden zal veroorzaken. Belangrijk is dat de bacteriën worden gedood, zodat C. elegans ze nog steeds zal eten. In onze ervaring zijn er drie manieren om grote hoeveelheden bacteriën betrouwbaar te doden: (i) bestraling door röntgenstralen, (ii) door γ-stralen en (iii) de toevoeging van formaldehyde29,30. De zelflysepercentages tussen deze drie methoden zijn vergelijkbaar, met een variatiecoëfficiënt van 8% tussen de zelflysepercentages voor de experimenten weergegeven in figuur 3B. Methoden die in onze handen niet betrouwbaar werkten, waren UV-bestraling, antibioticacocktails, warmte-inactivatie en natriumazide. Deze methoden slagen er niet in om de bacteriën volledig te doden (UV en antibiotica), produceren bacteriën die C. elegans niet eet (hitte) of veranderen de voedselinname (natriumazide).
Aantal replicaten:
Onze ervaring is dat de vouwveranderingen in de voeding over het algemeen klein zijn in vergelijking met de waargenomen variatie. Het meten van veranderingen in voedselinname vereist dus meerdere replicatieputjes. Figuur 2A,B toont platen met 96 putjes die zijn ontworpen voor vier of zes verschillende omstandigheden, met 21 of 14 replicatieputjes en twee zelflysecontroleputjes zonder wormen. Gezien de grote variabiliteit en de relatief kleine veranderingen die te verwachten zijn, zijn 0,5-2,5 voudige veranderingen in de voeding meestal de onder- en bovengrenzen. We raden 14 tot 21 replicatieputten aan voor elke aandoening en ten minste twee zelflysecontroleputten, die hierna worden beschreven. Deze replicaten zijn voldoende om kwantitatieve dosis-responscurves te genereren voor geneesmiddelen die de voeding veranderen11,26.
Controle van de zelflyse:
OD600 meet het aantal deeltjes in een oplossing, meestal onafhankelijk van de deeltjesgrootte. Dode bacteriën zullen echter lyseren en hun deeltjesaard verliezen. We noemen dit zelflyse, die onafhankelijk gebeurt in de aanwezigheid van wormen en de OD600-metingen verlaagt zonder dat de wormen eten. Zelflyse vindt plaats tijdens de test en moet onafhankelijk worden gemeten in ten minste twee putjes per aandoening. Deze putten krijgen dezelfde behandeling als de andere binnen dezelfde toestand, behalve dat ze geen wormen bevatten. We ontdekten dat veel medicijnen ook de zelflysesnelheid kunnen veranderen. Elke aandoening heeft dus onafhankelijke zelflyse-controleputten nodig met hun respectievelijke concentratie. Figuur 2 toont een plaatopstelling voor vier of zes condities met alle zelflyse-controleputjes aan de onderkant van de plaat in rij H.
N2 referentiepopulatie:
We merkten ook op dat de absolute hoeveelheid geconsumeerde bacteriën kan fluctueren tussen experimenten, hoogstwaarschijnlijk gerelateerd aan de kwaliteit van de bacteriën. Ondanks onze inspanningen om ze elke keer op precies dezelfde manier te bereiden, zijn er fluctuaties. Bacteriën kunnen bijvoorbeeld worden geoogst terwijl ze zich in een delende toestand bevinden tijdens de logaritmische groeifase en daarom veel groter zijn dan bacteriën die in de stationaire fase worden geoogst. Vandaar dat deze eenvoudige verschillen in bacteriegrootte kunnen leiden tot veranderingen in het aantal geconsumeerde bacteriën en verschillende OD600-waarden , aangezien de OD600-metingen geen onderscheid maken tussen groottes. Om deze reden nemen we altijd één populatie onbehandelde N2-controledieren op die als referentiewaarde dienen, ingesteld op 1 of 100%, om te bepalen of de experimentele groepen meer of minder eten dan de N2-controlegroep. Deze praktijk maakt vergelijkingen tussen experimenten mogelijk, zelfs als de OD600-waarden variëren.
Tijdsintervallen:
Het gebruik van OD600-waarden om de voedselinname te meten, vereist dat de bacterieconcentratie meetbaar afneemt. Omdat het kweekvolume veel groter is dan dat van de wormen, moeten ze een aanzienlijke hoeveelheid bacteriën eten om een detecteerbaar verschil te maken. Om binnen het lineaire bereik voor OD600-waarden te blijven, moet de bacterieconcentratie tussen ~1 mg/ml en 10 mg/ml blijven, zodat een aanzienlijke hoeveelheid bacteriën moet verdwijnen om deze te detecteren. Wormen eten het meest van laat L4 tot dag 4 van de volwassenheid vanwege de eierproductie. Dit interval is dus ideaal. Kortere intervallen zoals 24 uur kunnen11 worden gemeten, maar dat is aanzienlijk moeilijker en vereist ~40 putjes per toestand. Een andere optie om de voedselopname van larven te meten, is door het aantal dieren per put te verdubbelen. Het probleem met deze aanpak is echter dat te veel wormen de OD600-metingen zullen gaan beïnvloeden wanneer ze opgroeien.
Voorraadoplossingen voor te testen medicijnen:
Als geneesmiddelen zoals serotonine worden getest op hun vermogen om voeding te moduleren, houd dan rekening met het volgende bij het bereiden van voorraadoplossingen. We bereiden over het algemeen een 50x voorraad voor wateroplosbare medicijnen en voegen 3 μL toe aan elk putje (1:50), maar andere voorraadconcentraties (100x, 300x) werken ook. Als de geneesmiddelen echter worden verdund in andere oplosmiddelen dan water (bijv. DMSO), mag de uiteindelijke concentratie niet hoger zijn dan 0,5%. Oplosmiddelen worden snel schadelijk voor C. elegans. Voorraadoplossingen van geneesmiddelen opgelost in organische oplosmiddelen zoals DMSO moeten dus 300x of hoger zijn.
Scoren van levende en dode wormen:
De bepaling van levende en dode dieren is gebaseerd op de beweging van de worm. Sterk licht, vooral blauw licht, wordt gebruikt omdat het ervoor zorgt dat de dieren in beweging komen. Bovendien zal het scoren van het aantal dieren per put onthullen of er overtollige sterfgevallen zijn. Overmatige sterfgevallen kunnen optreden bij giftige stoffen of hoge concentraties (>0,5%) van verschillende oplosmiddelen, waaronder DMSO. Over het algemeen moeten er minder dan 1:100 (1%) dode dieren zijn. Borden kunnen 30 s bij 800 tpm worden geschud op de microtiterplaatschudder als het voedsel is bezonken en de populatie moeilijk te tellen wordt. Negeer putjes met mannetjes of meer dan 16 wormen (zie problemen).
Mogelijke problemen:
Onvoldoende schudden:
In een vloeibaar medium kunnen bacteriën gemakkelijk samenklonteren en zich op de bodem van de putjes nestelen. Onze ervaring is dat minder dan 20 minuten schudden er niet in kan slagen om bacterieklonten af te breken en opnieuw te suspenderen, waardoor onnauwkeurige OD600-metingen ontstaan. OD600 metingen in aanwezigheid van bacterieklonten zullen de bacterieconcentratie onderschatten. Te hoge instellingen van de shaker kunnen ertoe leiden dat de vloeistof aan de sealer blijft plakken. Zodra de sealer is verwijderd voor de OD600-meting , zal de vloeistof die aan de sealer kleeft resulteren in een lagere OD600-meting . Als er vloeistof op de sealer zit, draai de plaat dan snel op een lage snelheid (500-1.000 tpm) en schud opnieuw gedurende 5 minuten. Zorg er verder voor, zoals vermeld voor de metingen op dag 1 en dag 4, dat u binnen 10 minuten na het schudden van de platen leest om te voorkomen dat de bacteriën zich nestelen.
Verschillende absolute voedselinnamewaarden tussen experimenten:
Ondanks onze inspanningen om de bacteriële preparaten te standaardiseren, verschillen ze vaak op manieren die de voedselinname bij wormen beïnvloeden. Vanwege hun delende toestand verschillen bacteriën bijvoorbeeld in grootte op basis van of ze zijn geoogst in de logaritmische groei- of stationaire fase, waarbij de logaritmische bacteriën groter zijn. Omdat OD600-metingen geen onderscheid maken tussen maten, kunnen de verschillen in bacteriegrootte als gevolg van de fase waarin de bacteriën zijn geoogst, leiden tot de schijnbare verschillen die zijn waargenomen in de basale voedselinname tussen bacteriepreparaten. De beste manier om experimenten te vergelijken, is door altijd een onbehandelde N2-controlepopulatie op te nemen en de resultaten te normaliseren naar deze N2-populatie.
Effecten van drukte:
De bacterieconcentratie in dit protocol is voldoende om de OD600 gedurende ~72 uur in het lineaire bereik te houden voor 2-16 wormen per putje. Afhankelijk van het betreffende medicijn kan een putje met meer dan 16 wormen de bacterieconcentratie vóór de tweede meting uitputten. We ontdekten ook dat putten met één dier vaak onbetrouwbaar zijn. De lysisfactor weegt zwaarder dan wat een enkele worm eet. Vandaar dat kleine fouten bij het bepalen van de lysisfactor een onevenredige invloed hebben op putten met minder wormen.
We raden aan om putten uit te sluiten van statistische analyses als aan een van de onderstaande voorwaarden is voldaan. Er zijn mannetjes in de put (we hebben geen gegevens waarin de voedselinname tussen mannetjes en hermafrodieten wordt vergeleken); er zijn minder dan 2 wormen in de put of meer dan 16 wormen in de put; Wormen zijn dood bij de tweede lezing; of als er nakomelingen in de putten zitten omdat de FUdR is mislukt. FUdR is warmtegevoelig en wordt zelfs bij temperaturen tot 37 °C geïnactiveerd. Ontdooi FUdR altijd in water op kamertemperatuur.
Negatieve voedselinnamewaarden:
De voedselinnamewaarden zijn af en toe negatief, wat suggereert dat er op dag 4 meer voedsel is dan op dag 1. Negatieve voedselinnamewaarden kunnen duiden op een van de volgende factoren: een hoge zelflysesnelheid , mogelijk veroorzaakt door een toegevoegd medicijn dat inwerkt op de bacteriën, of negatieve voedselinnamewaarden, die kunnen suggereren dat de put besmet is en er iets anders dan wormen groeit. De zelflysepercentages nemen ook toe naarmate de bacteriën ouder worden; Daarom raden we aan om bacteriën te gebruiken die niet langer zijn dan een week oud. Er is een medicijn toegevoegd dat in de loop van de tijd neerslaat, waardoor de OD600-waarde wordt beïnvloed. Onvoldoende schudden op dag 1 kan leiden tot een lagere OD600-waarde als gevolg van bacterieklonten. De wormen ondergingen hypoxische stress. Dit gebeurt wanneer de verhouding tussen oppervlak en lucht niet voldoende is om zuurstofuitwisseling mogelijk te maken. Gebruik de specifieke plaat met 96 putjes in materialen en overschrijd niet 150 μL (120 μL + 30 μL FUdR) per putje. De afstand tussen het oppervlak van de put en de bodem waar de wormen leven, bepaalt de zuurstofconcentratie.
Beperkingen:
Deze test is beperkt tot vloeibare cultuur. Voedingsgedrag dat wordt waargenomen in vaste platen, zoals het op- en afrijden van voedselgazons, kan niet worden beoordeeld met de test.
The authors have nothing to disclose.
We willen Xiaolan Ye bedanken, aangezien dit protocol is ontwikkeld als gevolg van een observatie die ze oorspronkelijk maakte. Wij danken alle voormalige en huidige leden van het Petrascheck Lab voor hun hulp bij de ontwikkeling en optimalisatie van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door R21 AG080376 (aan M.P.). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave |
|
Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
|
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
|
S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C |
|
S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 |
|
Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |