Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica
Summary
Questo protocollo descrive un test per quantificare la velocità di alimentazione di Caenorhabditis elegans basato sulla misurazione della clearance dei batteri in coltura liquida.
Abstract
L’alimentazione è un processo biologico essenziale per la crescita, la riproduzione e la sopravvivenza di un organismo. Questo test mira a misurare l’assunzione di cibo di Caenorhabditis elegans (C. elegans), un parametro importante quando si studia la genetica dell’invecchiamento o del metabolismo. Nella maggior parte delle specie, l’alimentazione è determinata misurando la differenza tra la quantità di cibo fornita e la quantità rimasta dopo un determinato intervallo di tempo. Il metodo qui presentato utilizza la stessa strategia per determinare l’alimentazione di C. elegans. Misura la quantità di batteri, la fonte alimentare di C. elegans, eliminati entro 72 ore. Questo metodo utilizza piastre per microtitolazione a 96 pozzetti e ha permesso lo screening di centinaia di farmaci per la loro capacità di modulare l’assunzione di cibo a una velocità e una profondità non possibili in altri modelli animali. Il punto di forza di questo test è che consente di misurare contemporaneamente l’alimentazione e la durata della vita e misura direttamente la scomparsa del cibo e, quindi, si basa sugli stessi principi utilizzati per altri organismi, facilitando il confronto tra specie.
Introduction
Caenorhabditis elegans è stato ampiamente utilizzato nella ricerca sull’invecchiamento. È stato un modello potente per studiare la genetica alla base della longevità mediata dal metabolismo indotta dalla restrizione dietetica, dalla ridotta attività mitocondriale o dalla ridotta segnalazione dell’insulina. 1,2,3,4,5,6,7. Tuttavia, la misurazione dell’alimentazione nel contesto della longevità si è dimostrata difficile per C. elegans a causa delle piccole dimensioni dell’animale 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
L’alimentazione è un comportamento biologico fondamentale necessario per la sopravvivenza e la sua stretta regolazione è al centro del mantenimento della salute metabolica, della riproduzione e dell’invecchiamento. Il comportamento alimentare è controllato da molteplici vie di segnalazione sia nel sistema nervoso che nella periferia e, quindi, può essere studiato solo in vivo 16,17,18,19. L’alimentazione rappresenta il primo di tre pilastri: (i) l’assunzione di energia, (ii) l’immagazzinamento di energia e (iii) il dispendio energetico che governa l’omeostasi energetica di un organismo. L’alimentazione in C. elegans è stata principalmente studiata misurando il pompaggio faringeo, come definito dal tasso di contrazioni della faringe. Questo approccio ha fornito informazioni cruciali sul comportamento alimentare di C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; Tuttavia, il pompaggio faringeo, misurato soprattutto su brevi intervalli di minuti, non è necessariamente correlato all’assunzione di cibo.
L’assunzione di cibo non è determinata solo dalla velocità di pompaggio faringea, ma anche da parametri come la durata e la frequenza dei cicli di alimentazione e la densità dei batteri alimentari. Un animale può avere un pompaggio faringeo molto elevato, ma la durata dei suoi periodi di alimentazione può essere più breve, compensando l’aumento della velocità. Un altro fattore di confusione è l’efficienza con cui il pompaggio può o meno ingerire e macinare i batteri. Un esempio estremo di disaccoppiamento dell’assunzione di cibo dal pompaggio faringeo è l’aggiunta di serotonina senza la presenza di cibo (batteri). In presenza di serotonina esogena, gli animali pompano ad una velocità elevata, ma senza la presenza di batteri, l’elevata velocità di pompaggio non porta all’assunzione di cibo 2,6,13,22,23.
Il metodo di eliminazione batterica qui presentato misura l’assunzione di cibo delle popolazioni di vermi nei singoli pozzetti come il declino delle concentrazioni batteriche nel tempo (Figura 1). Questo approccio è simile a quelli utilizzati in altre specie in cui la scomparsa del cibo rappresenta una misura dell’assunzione di cibo 10,11,24,25,26,27,28. Nella pubblicazione originale, abbiamo convalidato questo metodo di misurazione dell’assunzione di cibo somministrando a C. elegans batteri marcati con isotopi 15N11. Successive misurazioni mediante spettrometria di massa hanno dimostrato che la misurazione della scomparsa dei batteri era fortemente correlata con il verificarsi della marcatura isotopica, rivelando l’effettivo assorbimento dei batteri nell’animale11. Pertanto, siamo fiduciosi che il test di clearance batterica rappresenti l’assunzione di cibo nella maggior parte delle circostanze. Lo scopo del test non è quello di sostituire il test di pompaggio faringeo, ma di aggiungere alla cassetta degli attrezzi dei test per studiare l’alimentazione e il metabolismo in C. elegans e come si relaziona con l’invecchiamento e la longevità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo ha presentato misure di clearance batterica come lettura per l’assunzione di cibo di C. elegans in piastre per microtitolazione a 96 pozzetti. Le curve dose-risposta nella sezione dei risultati rappresentativi mostrano che il test misura quantitativamente l’assunzione di cibo, una nozione che è stata confermata in modo indipendente utilizzando batteri marcati con isotopi11. Utilizzando questo test, abbiamo testato con successo farmaci approvati dalla FDA come gli antipsicotici con noti effetti collaterali metabolici umani e abbiamo dimostrato che questi farmaci aumentavano l’alimentazione in C. elegans10,26. Il test è utile per studiare la genetica o la farmacologia dell’alimentazione e aggiunge un nuovo strumento per la ricerca su C. elegans per studiare il metabolismo. Questo test fornisce un metodo a basso costo per studiare l’alimentazione in modo scalabile e rispettoso del tempo, cosa che non è possibile nella maggior parte degli altri organismi. Il nostro lavoro sui farmaci approvati dalla FDA mostra che molti effetti collaterali osservati nei pazienti umani sono osservati anche in C. elegans, rivelando la conservazione evolutiva 24,26,32.
Il test è limitato dalla concentrazione di batteri che può essere misurata all’interno dell’intervallo lineare della misura OD600 . Di conseguenza, il numero di vermi e la gamma di concentrazioni batteriche che possono essere analizzate sono limitati. Troppi vermi influenzeranno l’OD600 consumando i batteri troppo rapidamente, quindi “mangiando” la concentrazione batterica dall’OD600 lineare. Nella nostra esperienza, la variabilità nella preparazione batterica è il parametro critico che fa variare i risultati da un esperimento all’altro. Abbiamo cercato senza successo di congelare grandi lotti di batteri o di utilizzare batteri liofilizzati. In questi casi, o il tasso di autolisi è diventato troppo alto, o i batteri erano di una qualità tale da rallentare lo sviluppo di C. elegans . Tuttavia, i nostri test non sono stati esaustivi e questo problema potrebbe essere risolvibile.
In generale, il tasso di autolisi dei batteri è il più difficile da controllare e può causare una notevole variabilità. Abbiamo scoperto che alcuni farmaci possono aumentare il tasso di autolisi a livelli che il test non è in grado di determinare in modo affidabile l’assunzione di cibo. Poiché il tasso di autolisi aumenta nel tempo nel test, non abbiamo misurato l’assunzione di cibo oltre il 5° giorno dell’età adulta. A quell’età, i batteri sono ~10 giorni in coltura. Per misurare l’assunzione di cibo oltre il 5° giorno dell’età adulta, i vecchi batteri devono essere lavati via e sostituiti con quelli freschi.
Il test presentato è un’estensione del nostro saggio31 sulla durata di vita basato su piastre per microtitolazione a 96 pozzetti. Questa combinazione consente di misurare la durata della vita e l’assunzione di cibo nella stessa popolazione. Sebbene il test di clearance batterica qui presentato non consenta di determinare l’assunzione di cibo per l’intera vita di C. elegans a causa dell’autolisi batterica, fornisce dati solidi per i primi quattro giorni di età adulta, il periodo con la più alta assunzione di cibo. Soprattutto per la scoperta di farmaci a piccole molecole, il controllo dell’assunzione di cibo è essenziale. In sintesi, prevediamo che il test presentato sarà utile alla comunità di C. elegans e amplierà il set di strumenti per studiare il metabolismo o controllarlo nel contesto degli studi sull’invecchiamento e sulla durata della vita.
Pianificazione:
Prima di pianificare la misurazione dell’assunzione di cibo, è necessario fare alcune considerazioni.
Uccidere i batteri:
Uccidiamo i batteri mediante irradiazione con raggi X in una provetta conica da 50 mL (900 Gray per 4 ore impostata a 160,0 kV e 25,0 mA). Per l’irraggiamento utilizziamo l’RS2000 di Rad Source. A seconda dell’apparecchiatura, il tempo specifico e la dose di radiazioni possono variare da struttura a struttura. L’uccisione completa dei batteri deve essere determinata placcando i batteri dopo l’irradiazione per rilevare i sopravvissuti per crescita. È essenziale uccidere tutti i batteri per prevenire la crescita durante il test, poiché ciò causerà una sottostima dell’alimentazione o addirittura valori di alimentazione negativi. È importante sottolineare che i batteri devono essere uccisi in modo che C. elegans possa ancora mangiarli. Nella nostra esperienza, ci sono tre modi per uccidere in modo affidabile grandi quantità di batteri: (i) irradiazione con raggi X, (ii) con raggi γ e (iii) l’aggiunta di formaldeide29,30. I tassi di autolisi tra questi tre metodi sono comparabili, con un coefficiente di variazione dell’8% tra i tassi di autolisi per gli esperimenti mostrati nella Figura 3B. I metodi che non funzionavano in modo affidabile nelle nostre mani erano l’irradiazione UV, i cocktail di antibiotici, l’inattivazione del calore e l’azide di sodio. Questi metodi non riescono a uccidere completamente i batteri (UV e antibiotici), producono batteri che C. elegans non mangia (calore) o modificano l’assunzione di cibo (azoturo di sodio).
Numero di repliche:
Nella nostra esperienza, le variazioni di piega nell’alimentazione sono generalmente piccole rispetto alla variazione osservata. Pertanto, la misurazione dei cambiamenti nell’assunzione di cibo richiede diversi pozzetti replicati. Le figure 2A, B mostrano piastre a 96 pozzetti progettate per quattro o sei condizioni diverse, con 21 o 14 pozzetti di replica e due pozzetti di controllo dell’autolisi senza vermi. Data l’ampia variabilità e le variazioni relativamente piccole che ci si può aspettare, le variazioni di 0,5-2,5 volte nell’alimentazione tendono ad essere i limiti inferiore e superiore. Si raccomandano da 14 a 21 pozzetti di replica per ogni condizione e almeno due pozzetti di controllo dell’autolisi, descritti di seguito. Queste repliche sono sufficienti per generare curve dose-risposta quantitative per farmaci che cambiano l’alimentazione11,26.
Controlli di autolisi:
OD600 misura il numero di particelle in una soluzione, per lo più indipendentemente dalla dimensione delle particelle. Tuttavia, i batteri morti lisano, perdendo la loro natura di particelle. Chiamiamo questa autolisi, che avviene indipendentemente in presenza di vermi e abbassa le misurazioni di OD600 senza che i vermi mangino. L’autolisi avviene durante il test e deve essere misurata in modo indipendente in almeno due pozzetti per condizione. Questi pozzetti ricevono lo stesso trattamento degli altri nelle stesse condizioni, tranne per il fatto che non contengono vermi. Abbiamo scoperto che molti farmaci possono anche alterare il tasso di autolisi. Pertanto, ogni condizione necessita di pozzetti di controllo dell’autolisi indipendenti con la rispettiva concentrazione. La Figura 2 mostra una configurazione della piastra per quattro o sei condizioni con tutti i pozzetti di controllo dell’autolisi nella parte inferiore della piastra nella riga H.
Popolazione di riferimento N2:
Abbiamo anche notato che la quantità assoluta di batteri consumati può fluttuare tra gli esperimenti, molto probabilmente correlata alla qualità dei batteri. Nonostante i nostri migliori sforzi per prepararli esattamente allo stesso modo ogni volta, ci sono delle fluttuazioni. Ad esempio, i batteri possono essere raccolti mentre si trovano in uno stato di divisione durante la fase di crescita logaritmica e, quindi, essere di dimensioni molto più grandi rispetto ai batteri raccolti nella fase stazionaria. Pertanto, queste semplici differenze nelle dimensioni dei batteri possono portare a cambiamenti nel numero di batteri consumati e a diversi valori di OD600 poiché le misurazioni di OD600 non distinguono tra le dimensioni. Per questo motivo, includiamo sempre una popolazione di animali di controllo N2 non trattati che fungono da valore di riferimento, impostato su 1 o 100%, per determinare se i gruppi sperimentali mangiano più o meno del controllo N2. Questa pratica consente confronti tra esperimenti, anche se i valori OD600 variano.
Intervalli di tempo:
L’utilizzo di valori OD600 per misurare l’assunzione di cibo richiede che la concentrazione batterica diminuisca in modo misurabile. Poiché il volume di coltura è molto più grande dei vermi, devono mangiare una quantità significativa di batteri per fare una differenza rilevabile. Rimanere nell’intervallo lineare per i valori di OD600 richiede che la concentrazione batterica rimanga compresa tra ~1 mg/mL e 10 mg/mL in modo che una notevole quantità di batteri debba scomparire per rilevarlo. I vermi mangiano di più dalla fine dell’L4 al quarto giorno dell’età adulta a causa della produzione di uova. Pertanto, questo intervallo è l’ideale. Intervalli più brevi come 24 ore possono essere misurati11, ma è considerevolmente più difficile e richiede ~40 pozzetti per condizione. Un’altra opzione per misurare l’assunzione di cibo delle larve è quella di raddoppiare il numero di animali per pozzo. Tuttavia, il problema con questo approccio è che troppi vermi inizieranno a influenzare le letture OD600 quando crescono.
Soluzioni stock per i farmaci da testare:
Se farmaci come la serotonina vengono testati per la loro capacità di modulare l’alimentazione, considerare quanto segue quando si preparano le soluzioni stock. Generalmente prepariamo una riserva 50x per i farmaci idrosolubili e aggiungiamo 3 μl a ciascun pozzetto (1:50), ma funzionano anche altre concentrazioni di stock (100x, 300x). Tuttavia, se i farmaci sono diluiti in solventi diversi dall’acqua (ad esempio, DMSO), la concentrazione finale non deve superare lo 0,5%. I solventi diventano rapidamente dannosi per C. elegans. Pertanto, le soluzioni stock di farmaci disciolti in solventi organici come il DMSO devono essere 300x o superiori.
Punteggio di vermi vivi e morti:
La determinazione degli animali vivi e morti si basa sul movimento del verme. La luce forte, in particolare la luce blu, viene utilizzata perché fa muovere gli animali. Inoltre, il punteggio del numero di animali per pozzo rivelerà se ci sono morti in eccesso. Morti in eccesso possono verificarsi con sostanze tossiche o alte concentrazioni (>0,5%) di diversi solventi, incluso il DMSO. In generale, dovrebbero esserci meno di 1:100 (1%) animali morti. Le piastre possono essere agitate per 30 s a 800 giri/min sull’agitatore per piastre per microtitolazione se il cibo si è depositato e la popolazione diventa difficile da contare. Ignora i pozzi con maschi o più di 16 vermi (vedi problemi).
Potenziali problemi:
Agitazione inadeguata:
In un mezzo liquido, i batteri possono facilmente aggregarsi e depositarsi sul fondo dei pozzetti. Nella nostra esperienza, l’agitazione per meno di 20 minuti potrebbe non riuscire a rompere i grumi batterici e risospenderli, causando misurazioni imprecise di OD600 . Le misurazioni OD600 in presenza di grumi batterici sottostimeranno la concentrazione batterica. Impostazioni eccessive dell’agitatore possono causare l’adesione del liquido al sigillante. Una volta rimosso il sigillante per la lettura OD600 , il liquido attaccato al sigillante risulterà in una lettura OD600 inferiore. Se c’è del liquido sulla sigillatrice, girare rapidamente la piastra a bassa velocità (500-1.000 giri/min) e agitare di nuovo per 5 minuti. Inoltre, assicurati, come indicato per le letture del giorno 1 e del giorno 4, di leggere entro 10 minuti dallo scuotimento delle piastre per evitare che i batteri si depositino.
Diversi valori assoluti di assunzione di cibo tra gli esperimenti:
Nonostante i nostri migliori sforzi per standardizzare i preparati batterici, spesso differiscono in modi che influenzano l’assunzione di cibo nei vermi. Ad esempio, a causa del loro stato di divisione, i batteri differiscono in dimensioni a seconda che siano stati raccolti nella fase di crescita logaritmica o stazionaria, con i batteri logaritmici più grandi. A causa delle misurazioni OD600 che non distinguono tra le dimensioni, le differenze nelle dimensioni del batterio dovute alla fase in cui il batterio è stato raccolto possono portare alle apparenti differenze osservate nell’assunzione di cibo basale tra i preparati batterici. Il modo migliore per confrontare gli esperimenti è includere sempre una popolazione di controllo N2 non trattata e normalizzare i risultati a questa popolazione N2.
Effetti di affollamento:
La concentrazione batterica in questo protocollo è sufficiente per mantenere l’OD600 nell’intervallo lineare per 2-16 vermi per pozzetto per ~72 ore. A seconda del farmaco di interesse, un pozzetto contenente più di 16 vermi può esaurire la concentrazione batterica prima della seconda misurazione. Abbiamo anche scoperto che i pozzi con un solo animale tendono ad essere inaffidabili. Il fattore di lisi supera ciò che mangia un singolo verme. Pertanto, piccoli errori nella determinazione del fattore di lisi influenzano in modo sproporzionato i pozzi con meno vermi.
Si consiglia di escludere i pozzi dalle analisi statistiche se è soddisfatta una delle condizioni seguenti. Ci sono maschi nel pozzo (non abbiamo dati che confrontino l’assunzione di cibo tra maschi ed ermafroditi); ci sono meno di 2 vermi nel pozzo o più di 16 vermi nel pozzo; i vermi sono morti alla seconda lettura; o se ci sono progenie nei pozzi perché il FUdR ha fallito. Il FUdR è sensibile al calore e si inattiva anche a temperature fino a 37 °C. Scongelare sempre il FUdR in acqua a temperatura ambiente.
Valori negativi di assunzione di cibo:
I valori di assunzione di cibo sono occasionalmente negativi, suggerendo che il giorno 4 è presente una quantità maggiore di cibo rispetto al giorno 1. Valori negativi di assunzione di cibo possono indicare uno dei seguenti fattori: un alto tasso di autolisi , probabilmente causato da un farmaco aggiunto che agisce sui batteri, o valori negativi di assunzione di cibo, che possono suggerire che il pozzo è contaminato e che sta crescendo qualcosa di diverso dai vermi. I tassi di autolisi aumentano anche con l’avanzare dell’età dei batteri; Pertanto, si consiglia di utilizzare batteri di età non superiore a una settimana. È stato aggiunto un farmaco che precipita nel tempo, influenzando il valore di OD600 . Un agitazione insufficiente il giorno 1 può portare a una lettura OD600 inferiore a causa di grumi batterici. I vermi sono stati sottoposti a stress ipossico. Ciò si verifica quando il rapporto superficie-aria non è sufficiente per consentire lo scambio di ossigeno. Utilizzare la piastra specifica a 96 pozzetti nei materiali e non superare i 150 μL (120 μL + 30 μL di FUdR) per pozzetto. La distanza tra la superficie del pozzo e il fondo dove vivono i vermi determina la concentrazione di ossigeno.
Limitazioni:
Questo test è limitato alla coltura liquida. I comportamenti alimentari osservati nelle piastre solide, come muoversi su e fuori dai prati alimentari, non possono essere valutati con il test.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vogliamo ringraziare Xiaolan Ye, poiché questo protocollo è stato sviluppato a seguito di un’osservazione che ha fatto inizialmente. Ringraziamo tutti i membri passati e presenti del Petrascheck Lab per il loro aiuto nello sviluppo e nell’ottimizzazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato da R21 AG080376 (a M.P.). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall’Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).
Materials
| Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
| Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
| Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
| M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave |
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| Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
| Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
| Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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| Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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| S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C |
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| S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 |
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| Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
| Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
| Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
| Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |
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