このプロトコルは、液体培養中の細菌のクリアランスの測定に基づいて 、線虫の 摂食速度を定量化するアッセイについて説明しています。
摂食は、生物の成長、繁殖、生存に不可欠な生物学的プロセスです。このアッセイは、老化や代謝の遺伝学を研究する際の重要なパラメータである Caenorhabditis elegans(C.elegans)の食物摂取量を測定することを目的としています。ほとんどの種では、摂食は、提供された食物の量と特定の時間間隔後に残された量との差を測定することによって決定されます。ここで紹介する方法は、 C.エレガンスの摂食を決定するために同じ戦略を使用します。 これは、C.エレガンスの食物源である細菌が72時間以内に除去された量を測定します。この方法では、96ウェルマイクロタイタープレートを使用し、他の動物モデルでは不可能な速度と深さで食物摂取を調節する能力について、数百種類の薬物のスクリーニングを可能にしました。このアッセイの強みは、摂食と寿命を同時に測定し、食物の消失を直接測定できるため、他の生物と同じ原理に基づいており、種間比較が容易になることです。
線虫は老化研究に広く使用されてきました。 これは、食事制限、ミトコンドリア活性の低下、またはインスリンシグナル伝達の減少によって引き起こされる代謝媒介性の長寿の根底にある遺伝学を研究するための強力なモデルです。1、2、3、4、5、6、7。しかし、C.エレガンスでは、動物3,8,9,10,11,12,13,14,15のサイズが小さいため、長寿の文脈での摂食の測定が困難であることが証明されています。
摂食は生存に必要な基本的な生物学的行動であり、その厳格な規制は、代謝の健康、生殖、および老化の維持の中核にあります。摂食行動は、神経系と末梢の両方で複数のシグナル伝達経路によって制御されているため、in vivoでしか研究できません16,17,18,19。摂食は、(i)エネルギー摂取、(ii)エネルギー貯蔵、(iii)生物のエネルギー恒常性を支配するエネルギー消費の3つの柱の最初のものを表しています。C.エレガンスの摂食は、主に咽頭の収縮率によって定義される咽頭ポンプを測定することによって調査されてきました。このアプローチは、C.エレガンスの摂食行動3,4,8,12,13,20,21;ただし、咽頭ポンプは、特に短い数分間隔で測定され、必ずしも食物摂取と相関しているわけではありません。
食物摂取量は、咽頭のポンプ速度だけでなく、摂食発作の期間や頻度、食物細菌の密度などのパラメーターによっても決定されます。動物は咽頭のポンピングが非常に高い場合がありますが、摂食発作の長さが短くなり、増加率が相殺される可能性があります。別の交絡因子は、ポンピングがバクテリアを摂取して粉砕する場合としない場合の効率です。咽頭ポンプから食物摂取を切り離す極端な例は、食物(細菌)を存在させないセロトニンの追加です。外因性セロトニンの存在下では、動物は高い速度でポンプしますが、バクテリアが存在しないため、高いポンプ速度は食物摂取につながりません2,6,13,22,23。
ここで紹介するバクテリアクリアランス法は、個々のウェルにおける線虫集団の食物摂取量を、時間の経過とともに細菌濃度が減少する様子として測定します(図1)。このアプローチは、食物の消失が食物摂取量の尺度を表す他の種で使用されるものと似ています10,11,24,25,26,27,28。元の出版物では、C.エレガンスに15N同位体標識細菌11を与えることにより、食物摂取量を測定するこの方法を検証しました。その後の質量分析法による測定では、細菌の消失の測定は同位体標識の発生と強く相関していることが示され、細菌の動物への実際の取り込みが明らかになった11。したがって、バクテリアクリアランスアッセイは、ほとんどの状況で食物摂取量を表していると確信しています。このアッセイの目的は、咽頭ポンプアッセイを置き換えることではなく、C.エレガンスの摂食と代謝、およびそれが老化と長寿にどのように関連しているかを研究するためのアッセイのツールボックスに追加することです。
提示されたプロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレートでのC.エレガンスの食物摂取量の読み出しとして細菌クリアランスを測定します。代表的な結果セクションの用量反応曲線は、アッセイが食物摂取量を定量的に測定することを示しており、この概念は同位体標識細菌11を用いて独立して確認された。このアッセイを用いて、抗精神病薬などのFDA承認薬をヒト代謝副作用が知られている試験に成功し、これらの薬剤が線虫10,26の摂食を増加させることを示しました。このアッセイは、摂食の遺伝学または薬理学の研究に有用であり、C.エレガンス研究のための新しいツールを追加して代謝を研究します。このアッセイは、他のほとんどの生物では不可能な、スケーラブルで時間にやさしい方法で摂食を研究するための低コストの方法を提供します。FDA承認薬に関する私たちの研究は、ヒト患者に見られる多くの副作用がC.エレガンスでも観察されることを示しており、進化的保存を明らかにしています24,26,32。
アッセイは、OD600測定の線形範囲内で測定できる細菌の濃度によって制限されます。その結果、アッセイできる線虫の数と細菌濃度の範囲が限られています。寄生虫が多すぎると、細菌の消費が速すぎるため、線状OD600から細菌濃度が「食べられる」ため、OD600に影響を及ぼします。私たちの経験では、細菌調製物のばらつきは、実験ごとに結果が異なる原因となる重要なパラメーターです。大量のバクテリアを凍結したり、凍結乾燥バクテリアを使用したりしようと試みましたが、失敗に終わりました。これらの場合、自己分解率が高すぎたか、細菌の質がC.エレガンスの発達を遅らせたかのどちらかでした。ただし、私たちのテストは網羅的ではなく、この問題は解決できる可能性があります。
一般に、細菌の 自己分解 速度を制御するのが最も困難であり、かなりの変動を引き起こす可能性があります。一部の薬剤は、アッセイでは食物摂取量を確実に決定できないレベルまで 自己溶解率を高めることができることがわかりました。アッセイでは 自己溶解 率が時間とともに増加するため、成人期の5日目以降の食物摂取量は測定していません。その年齢までに、細菌は培養に~10日かかります。成人期の5日目を過ぎた食物摂取量を測定するには、古い細菌を洗い流して新しい細菌と交換する必要があります。
提示されたアッセイは、当社の96ウェルマイクロタイタープレートベースの寿命アッセイ31の拡張です。この組み合わせにより、同じ集団の寿命と食物摂取量を測定できます。ここで紹介する細菌クリアランスアッセイでは、細菌の自己分解により、C.エレガンスの生涯にわたる食物摂取量を決定することはできませんが、食物摂取量が最も多い成人期の最初の4日間については確かなデータを提供します。特に低分子創薬では、食物摂取のコントロールが不可欠です。要約すると、提示されたアッセイは、C.エレガンスコミュニティにとって有用であり、老化と寿命の研究の文脈で代謝を研究したり、それを制御したりするためのツールセットを拡大すると予想しています。
企画:
食物摂取量の測定を計画する前に、いくつかの考慮事項を考慮する必要があります。
バクテリアを殺す:
50mLのコニカルチューブ(160.0kV、25.0mAで900Grayを4時間設定)にX線を照射することで細菌を死滅させます。照射にはRad SourceのRS2000を使用しています。施設によっては、具体的な時間や放射線量が異なる場合があります。細菌の完全な死滅は、放射線照射後に細菌をめっきして生存者を成長させることによって決定する必要があります。アッセイ中の増殖を防ぐためには、すべての細菌を殺すことが不可欠です。これは、摂食値の過小評価やマイナスの摂食値を引き起こす原因となります。重要なことは、C.エレガンスがまだそれらを食べるように、バクテリアを殺さなければならないということです。私たちの経験では、大量の細菌を確実に殺すには、(i)X線による照射、(ii)γ線による照射、(iii)ホルムアルデヒドの添加、29,30の3つの方法があります。これら 3 つの方法の自己溶解率は同等であり、図 3B に示す実験の自己溶解速度間の変動係数は 8% です。私たちの手の中で確実に機能しなかった方法は、UV照射、抗生物質カクテル、熱不活化、およびアジ化ナトリウムでした。これらの方法は、バクテリアを完全に殺すことができない(UVと抗生物質)、C.エレガンスが食べないバクテリアを生成する(熱)か、食物摂取量を変更する(アジ化ナトリウム)かのどちらかです。
反復数:
私たちの経験では、摂食の倍率変化は、観察された変動と比較して一般的に小さいです。したがって、食物摂取量の変化を測定するには、いくつかの複製ウェルが必要です。図2A、Bは、4つまたは6つの異なる条件用に設計された96ウェルプレートを示しており、21または14の複製ウェルと2つのワームのない自己分解制御ウェルがあります。大きな変動性と予想される比較的小さな変化を考えると、摂食の0.5〜2.5倍の変化が下限と上限になる傾向があります。各条件に対して 14 から 21 のレプリケートウェルと、次に説明する 2 つ以上の自己分解制御ウェルを推奨します。これらの反復は、摂食11,26を変更する薬物の定量的用量反応曲線を生成するのに十分である。
Selflysisコントロール:
OD600は、溶液中の粒子の数を測定し、主に粒子サイズとは無関係です。ただし、死んだバクテリアは溶解し、粒子の性質を失います。これを自己溶解と呼び、これはワームの存在下で独立して発生し、ワームが食べずにOD600測定値を低下させます。自己溶解はアッセイ中に起こり、条件ごとに少なくとも2つのウェルで独立して測定する必要があります。これらの井戸は、ワームが含まれていないことを除いて、同じ条件内の他の井戸と同じ治療を受けます。また、多くの薬剤が自己溶解率を変化させることもわかりました。したがって、各条件には、それぞれの濃度で独立した自己分解制御井戸が必要です。図2は、行Hのプレートの下部にあるすべての自己分解制御ウェルを備えた4つまたは6つの条件のプレートセットアップを示しています。
N2参照母集団:
また、消費される細菌の絶対量は実験間で変動する可能性があり、おそらく細菌の品質に関連している可能性が高いことにも注目しました。毎回まったく同じ方法で準備するために最善を尽くしても、変動があります。例えば、細菌は対数成長期の分裂状態で採取できるため、固定期に採取される細菌よりもはるかに大きなサイズになります。したがって、これらの細菌サイズの単純な違いは、OD600の測定値がサイズを区別しないため、消費される細菌の数や異なるOD600値の変化につながる可能性があります。このため、実験グループがN2コントロールよりも多く食べるか少ないかを判断するために、参照値として機能する未処理のN2コントロール動物の集団を常に1つ含めます。この方法により、OD600の値が異なる場合でも、実験間の比較が可能になります。
時間間隔:
OD600 値を使用して食物摂取量を測定するには、細菌濃度が測定可能なほど低下する必要があります。培養量は線虫よりもはるかに大きいため、検出可能な違いを生じさせるには、かなりの量の細菌を食べる必要があります。OD600 値の線形範囲にとどまるには、細菌濃度が ~1 mg/mL から 10 mg/mL の間にとどまる必要があり、それを検出するにはかなりの量の細菌が消失する必要があります。ワームは、産卵のためにL4後期から成虫期の4日目に最も多く食べます。したがって、この間隔は理想的です。24時間のような短い間隔は11時間測定できますが、それはかなり難しく、条件ごとに~40ウェルが必要です。幼虫の食物摂取量を測定する別のオプションは、井戸あたりの動物の数を2倍にすることです。ただし、このアプローチの問題は、成長したときに OD600 の読み取り値に影響を与え始める線虫が多すぎることです。
試験対象の医薬品のストックソリューション:
セロトニンなどの薬物が摂食を調節する能力について試験される場合は、ストック溶液を調製する際に次の点を考慮してください。通常、水溶性医薬品には50倍のストックを調製し、各ウェルに3μL(1:50)を添加しますが、他のストック濃度(100倍、300倍)も機能します。ただし、薬物を水以外の溶媒(DMSOなど)で希釈する場合、最終濃度は0.5%を超えてはなりません。溶剤はすぐに C.エレガンに有害になります。したがって、DMSOなどの有機溶媒に溶解した薬物の原液は300倍以上でなければなりません。
生きているワームと死んだワームのスコアリング:
生きている動物と死んだ動物の判断は、ワームの動きに基づいています。強い光、特にブルーライトは動物を動かしてしまうため、使われます。さらに、井戸あたりの動物の数をスコアリングすると、超過死亡があるかどうかが明らかになります。過剰死亡は、有毒物質や高濃度(>0.5%)のDMSOを含むいくつかの溶媒で発生する可能性があります。一般的に、死んだ動物は1:100(1%)未満である必要があります。プレートは、食品が落ち着き、個体数を数えるのが難しくなった場合、マイクロタイタープレートシェーカーで800rpmで30秒間振とうすることができます。オスまたは16匹以上のワームがいる井戸は無視してください(問題を参照)。
潜在的な問題:
不適切な振とう:
液体培地では、バクテリアは簡単に凝集してウェルの底に定着します。私たちの経験では、20分未満振とうすると、細菌の凝集体が分解されて再懸濁されず、OD600 の測定が不正確になる可能性があります。細菌の塊の存在下でのOD600 測定は、細菌濃度を過小評価します。シェーカーの設定が多すぎると、液体がシーラーに付着する可能性があります。OD600 の読み取りのためにシーラーを取り外すと、シーラーに付着した液体により、OD600 の読み取り値が低くなります。シーラーに液体が付着している場合は、プレートを低速(500〜1,000 rpm)ですばやく回転させ、再度5分間振とうします。さらに、 1日目 と 4日目 の測定値で述べたように、細菌が落ち着かないように、プレートを振ってから10分以内に読むようにしてください。
実験間で異なる絶対食物摂取量値:
細菌製剤を標準化するための最善の努力にもかかわらず、それらはしばしば線虫の食物摂取に影響を与える方法で異なります。例えば、細菌は分裂状態であるため、対数成長期と固定相のどちらで採取されたかによって大きさが異なり、対数菌の方が大きくなります。OD600 の測定ではサイズが区別されないため、バクテリアが収穫された段階によるバクテリアのサイズの違いにより、バクテリア製剤間の基礎食品摂取量に明らかな違いが観察される可能性があります。実験間を比較する最善の方法は、常に未処理のN2コントロール集団を含め、結果をこのN2母集団に正規化することです。
混雑効果:
このプロトコルの細菌濃度は、OD600 をウェルあたり2〜16本の線虫に対して~72時間直線的範囲に保つのに十分です。目的の薬剤によっては、16を超える線虫を含むウェルでは、2回目の測定前に細菌濃度が枯渇する可能性があります。また、1匹の動物がいる井戸は信頼性が低い傾向があることもわかりました。溶解因子は、1匹のワームが食べるものよりも重要です。したがって、溶解因子を決定する際の小さなエラーは、ワームが少ない井戸に不釣り合いに影響を及ぼします。
以下の条件のいずれかが満たされる場合は、統計分析から井戸を除外することをお勧めします。井戸の中にはオスがいます(オスと雌雄同体の食物摂取量を比較したデータはありません)。井戸には2匹未満のワームがいるか、井戸には16匹以上のワームがいます。ワームは2回目の読み取りで死んでいます。または、FUdRが失敗したために井戸に子孫がいるかどうか。FUdRは熱に敏感で、37°Cという低い温度でも不活性化されます。 FUdRは常に室温の水で解凍してください。
ネガティブな食物摂取量:
食物摂取量は時折マイナスであり、1日目よりも4日目の方が食物が多いことを示唆しています。食物摂取量のマイナス値は、次の要因のいずれかを示している可能性があります:自己 分解 率が高い(おそらく細菌に作用する薬物が原因)、または食物摂取量がマイナスで、井戸が汚染されており、ワーム以外の何かが成長していることを示唆している可能性があります。 自己分解 率も、細菌が年をとるにつれて増加します。したがって、生後1週間以内の細菌を使用することをお勧めします。時間の経過とともに沈殿する薬剤が追加され、OD600 値に影響を与えます。1日目の振とうが不十分だと、細菌の塊によりOD600 の読み取り値が低下する可能性があります。線虫は低酸素ストレスを受けました。これは、地表と空気の比率が酸素交換を可能にするのに十分でない場合に発生します。材料には特定の96ウェルプレートを使用し、ウェルあたり150 μL(120 μL + 30 μLのFUdR) を超えないようにしてください 。井戸の表面とワームが生息する底との間の距離によって、酸素濃度が決まります。
制限:
このアッセイは液体培養に限定されています。食品の芝生に出入りするなど、固体プレートで観察される摂食行動は、このアッセイでは評価できません。
The authors have nothing to disclose.
Xiaolan Ye氏に感謝したいと思います。このプロトコルは、彼女が最初に行った観察の結果として開発されたものです。このプロトコルの開発と最適化にご協力いただいたPetrascheck Labの過去および現在のすべてのメンバーに感謝します。この作業は、R21 AG080376 (to M.P.) によって資金提供されました。一部の株は、NIH研究インフラストラクチャープログラム局(P40 OD010440)が資金提供するCGCによって提供されました。
Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave |
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Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C |
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S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 |
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Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |