Schatting van structurele gevoeligheid van intrinsiek ongeordende regio's als reactie op hyperosmotische stress in levende cellen met behulp van FRET
Summary
Intrinsiek ongeordende regio’s (IDR’s) zijn flexibele eiwitdomeinen die hun conformatie wijzigen als reactie op veranderingen in de omgeving. Ensemble fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) kan eiwitdimensies onder verschillende omstandigheden schatten. We presenteren een FRET-benadering om de structurele gevoeligheid van IDR te beoordelen in levende Saccharomyces cerevisiae-cellen onder hyperosmotische stress.
Abstract
Intrinsiek ongeordende regio’s (IDR’s) zijn eiwitdomeinen die deelnemen aan cruciale cellulaire processen. Tijdens stressomstandigheden veranderen de fysisch-chemische eigenschappen van de cellulaire omgeving, wat een directe invloed heeft op het conformationele ensemble van IDR’s. IDR’s zijn inherent gevoelig voor verstoringen van het milieu. Het bestuderen van hoe de fysisch-chemische eigenschappen van de cel het conformationele ensemble van IDR’s reguleren, is essentieel voor het begrijpen van de omgevingscontrole van hun functie. Hier beschrijven we een stap-voor-stap methode voor het meten van de structurele gevoeligheid van IDR’s in levende Saccharomyces cerevisiae cellen als reactie op hyperosmotische stresscondities. We presenteren het gebruik van ensemble fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) om in te schatten hoe de globale dimensies van IDR’s veranderen tijdens een progressieve toename van hyperosmotische stress die wordt opgelegd aan cellen met een osmolyt. Daarnaast bieden we een script voor het verwerken van fluorescentiemetingen en het vergelijken van structurele gevoeligheid voor verschillende IDR’s. Door deze methode te volgen, kunnen onderzoekers waardevolle inzichten verkrijgen in de conformatieveranderingen die IDR’s ondergaan in het complexe intracellulaire milieu bij veranderende omgevingen.
Introduction
Intrinsiek ongeordende regio’s (IDR’s) zijn cruciale componenten in cellulaire processen1. In combinatie met gestructureerde domeinen zijn IDR’s essentieel voor eiwitfuncties. De aminozuursamenstelling van IDR’s is vertekend en wordt voornamelijk weergegeven door geladen, hydrofiele en kleine residuen. Vanwege deze eigenschap worden IDR’s beschouwd als domeinen met een lage complexiteit 2,3. Talrijke IDR’s hebben de aandacht getrokken, vooral omdat deze regio’s een cruciale rol spelen bij pathologische aandoeningen, met name neurodegeneratieve ziekten. Dergelijke ziekten worden gekenmerkt door zelfassemblage en daaropvolgende extracellulaire of intracellulaire afzetting van IDR’s in neuronen4. Voorbeelden van dergelijke IDR’s zijn amyloïde-β (Aβ) bij de ziekte van Alzheimer, huntingtine (HTT) bij de ziekte van Huntington en TAR DNA-bindend eiwit-43 (TDP-43) en gefuseerd bij sarcoom (FUS) bij amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale dementie4. De studie van de structurele herschikkingen van IDR’s in de context van ziekte is aanzienlijk verbeterd door spectroscopische methoden, waaronder fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET).
De hydrofiele en uitgebreide aard van IDR’s maakt ze uiterst gevoelig voor veranderingen in de fysisch-chemische eigenschappen van de oplossingsomgeving5. De mate waarin het conformationele ensemble van IDR’s wordt gewijzigd door de omgeving wordt structurele gevoeligheid genoemd 5,6,7. Er kunnen verschillende technieken worden gebruikt om de conformatie en dynamiek van IDR’s te bestuderen, waaronder circulair dichroïsme (CD) en röntgenverstrooiing onder kleine hoek (SAXS)8,9. Helaas hebben CD en SAXS grote hoeveelheden gezuiverde eiwitten nodig, dus ze zijn niet geschikt voor studies in cellen. FRET daarentegen is een techniek die de fluorescentie-intensiteit meet van twee fluorescerende moleculen die specifiek één IDR labelen, wat betekent dat ze kunnen worden gecontroleerd in complexe mengsels zoals levende cellen10. Het dynamisch meten van de structurele gevoeligheid van IDR’s in levende cellen is noodzakelijk om te begrijpen hoe de omgeving de conformatie en functie van het ongeordende proteoom reguleert.
FRET is een krachtige methode voor het kwantificeren van de structurele gevoeligheid van IDR’s, evenals bolvormige en multidomeineiwitten in levende cellen. De methode vereist een construct dat bestaat uit een IDR van belang ingeklemd tussen twee fluorescerende eiwitten (FP), bekend als een FRET-paar. Voor dit protocol stellen we het gebruik van mCerulean3 voor als de donor-FP en Citrien als de acceptor-FP, vanwege hun grote dynamische bereik, in vergelijking met andere FP’s gerapporteerd in een eerdere studie over IDR-gevoeligheid6. FRET is eerder gebruikt om de structurele gevoeligheid van een planten-IDR in verschillende cellulaire contexten te meten6. Bovendien is deze techniek gebruikt om de totale eiwitdimensies van IDR’s te karakteriseren door verschillende onderzoeksgroepen, zowel in vitro als in vivo 5,11.
Hier beschrijven we de ensemble FRET-methode voor het bestuderen van de structurele gevoeligheid van IDR’s in levende gistcellen (Saccharomyces cerevisiae). We laten representatieve resultaten zien die zijn gebaseerd op een fabrieks-IDR genaamd AtLEA4-5. AtLEA4-5 is ongeordend in oplossing, maar vouwt zich in α-helix wanneer macromoleculaire verdringing in vitro wordt geïnduceerd 12. AtLEA4-5 is een goed referentiemodel voor deze methode omdat het relatief klein is (158 residuen), ongeordend en gevoelig voor verstoring van het milieu, zoals gerapporteerd in silico en in vitro 6,12. De hier gepresenteerde methode kan worden geschaald voor benaderingen met een hoge doorvoer, omdat gistcellen gemakkelijk te kweken zijn en de behandeling in kleine volumes wordt toegepast. Bovendien kunnen kleine aanpassingen aan het protocol worden toegepast op andere cellulaire systemen zoals bacteriën en plantencellen6. Het protocol kan worden uitgevoerd in elk moleculair biologisch laboratorium met toegang tot een microplaatlezer met fluorescentiemodus, een apparatuur die beschikbaar is in de meeste onderzoeksinstellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde methode biedt een manier om inzicht te krijgen in hoe de mondiale dimensies van het ensemble van IDR’s omgevingsverstoringen waarnemen en erop reageren. Deze methode is gebaseerd op een genetisch gecodeerd construct en vereist geen extra componenten behalve een plasmidestabiele expressie in gistcellen, waardoor het aanpasbaar is voor mogelijke toepassingen in andere celtypen. Bovendien is het veelzijdig voor het onderzoeken van andere fysisch-chemische verstoringen die eukaryote cellen tijdens hun …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de leden van het Cuevas-Velazquez-lab voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) projectnummer IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), projectnummer 252952; en Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) en CAPD (CVU 1269643) erkennen CONAHCYT voor hun M.Sc. Scholarship.
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
References
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
- Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
- Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
- Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
- Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
- Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
- Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
- Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
- Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
- Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
- Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
- Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
- JoVE Science Education Database. . Restriction enzyme digests. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Gel purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA ligation reactions. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Plasmid purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA gel electrophoresis. , (2023).
- JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides – Concept Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023)
- Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
- Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
- Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
- Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
- Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
- Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
- Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
- Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
- Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
- Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).
