Stima della sensibilità strutturale di regioni intrinsecamente disordinate in risposta allo stress iperosmotico in cellule viventi utilizzando FRET
Summary
Le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) sono domini proteici flessibili che modificano la loro conformazione in risposta ai cambiamenti ambientali. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza d’insieme (FRET) può stimare le dimensioni delle proteine in diverse condizioni. Presentiamo un approccio FRET per valutare la sensibilità strutturale dell’IDR in cellule viventi di Saccharomyces cerevisiae in condizioni di stress iperosmotico.
Abstract
Le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) sono domini proteici che partecipano a processi cellulari cruciali. Durante le condizioni di stress, le proprietà fisico-chimiche dell’ambiente cellulare cambiano, influenzando direttamente l’insieme conformazionale degli IDR. Gli esami approfonditi sono intrinsecamente sensibili alle perturbazioni ambientali. Studiare come le proprietà fisico-chimiche della cellula regolano l’insieme conformazionale degli IDR è essenziale per comprendere il controllo ambientale della loro funzione. Qui, descriviamo un metodo passo-passo per misurare la sensibilità strutturale degli IDR in cellule viventi di Saccharomyces cerevisiae in risposta a condizioni di stress iperosmotico. Presentiamo l’uso del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza d’insieme (FRET) per stimare come cambiano le dimensioni globali degli IDR durante un progressivo aumento dello stress iperosmotico imposto alle cellule con qualsiasi osmolito. Inoltre, forniamo uno script per l’elaborazione delle misure di fluorescenza e il confronto della sensibilità strutturale per diversi IDR. Seguendo questo metodo, i ricercatori possono ottenere preziose informazioni sui cambiamenti conformazionali che gli IDR subiscono nel complesso ambiente intracellulare al variare degli ambienti.
Introduction
Le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) sono componenti fondamentali nei processi cellulari1. In combinazione con i domini strutturati, gli IDR sono essenziali per le funzioni proteiche. La composizione amminoacidica degli IDR è distorta, rappresentata principalmente da residui carichi, idrofili e di piccole dimensioni. A causa di questa proprietà, gli esami approfonditi sono considerati domini a bassa complessità 2,3. Numerosi esami approfonditi hanno attirato l’attenzione, principalmente perché queste regioni svolgono un ruolo cruciale nelle condizioni patologiche, in particolare nelle malattie neurodegenerative. Tali malattie sono caratterizzate dall’auto-assemblaggio e dalla successiva deposizione extracellulare o intracellulare di IDR nei neuroni4. Esempi di tali IDR includono l’amiloide-β (Aβ) nella malattia di Alzheimer, l’huntingtina (HTT) nella malattia di Huntington e la proteina-43 legante il DNA TAR (TDP-43) e fusa nel sarcoma (FUS) nella sclerosi laterale amiotrofica e nella demenza frontotemporale4. Lo studio dei riarrangiamenti strutturali degli IDR nel contesto della malattia è stato significativamente migliorato da metodi spettroscopici, tra cui il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).
La natura idrofila ed estesa degli IDR li rende estremamente sensibili ai cambiamenti nelle proprietà fisico-chimiche dell’ambiente della soluzione5. Il grado in cui l’insieme conformazionale degli IDR viene modificato dall’ambiente è chiamato sensibilità strutturale 5,6,7. Diverse tecniche possono essere utilizzate per studiare la conformazione e la dinamica degli IDR, tra cui il dicroismo circolare (CD) e lo scattering di raggi X a piccolo angolo (SAXS)8,9. Sfortunatamente, CD e SAXS richiedono grandi quantità di proteine purificate, quindi non sono appropriati per gli studi sulle cellule. Al contrario, la FRET è una tecnica che misura l’intensità della fluorescenza di due molecole fluorescenti che marcano specificamente un IDR, il che significa che possono essere monitorate in miscele complesse come le cellule viventi10. Misurare dinamicamente la sensibilità strutturale degli IDR nelle cellule viventi è necessario per comprendere come l’ambiente regola la conformazione e la funzione del proteoma disordinato.
La FRET è un metodo potente per quantificare la sensibilità strutturale degli IDR, nonché delle proteine globulari e multidominio nelle cellule viventi. Il metodo richiede un costrutto costituito da un IDR di interesse inserito tra due proteine fluorescenti (FP), noto come coppia FRET. Per questo protocollo, suggeriamo l’uso di mCerulean3 come FP donatore e Citrine come FP accettore, a causa del loro ampio range dinamico, rispetto ad altri FP riportati in un precedente studiosulla sensibilità 6 degli IDR. La FRET è stata precedentemente sfruttata per misurare la sensibilità strutturale di una pianta IDR in diversi contesti cellulari6. Inoltre, questa tecnica è stata utilizzata per caratterizzare le dimensioni proteiche complessive degli IDR da diversi gruppi di ricerca sia in vitro che in vivo 5,11.
In questo articolo, descriviamo il metodo FRET d’insieme per studiare la sensibilità strutturale degli IDR in cellule di lievito viventi (Saccharomyces cerevisiae). Mostriamo risultati rappresentativi che si basano su un IDR di pianta chiamato AtLEA4-5. AtLEA4-5 è disordinato in soluzione, ma si ripiega in α-elica quando l’affollamento macromolecolare è indotto in vitro12. AtLEA4-5 è un buon modello di riferimento per questo metodo perché è relativamente piccolo (158 residui), disordinato e sensibile alle perturbazioni ambientali come riportato in silico e in vitro 6,12. Il metodo qui presentato può essere scalato per approcci ad alto rendimento perché le cellule di lievito sono facili da coltivare e il trattamento viene applicato in piccoli volumi. Inoltre, piccole modifiche al protocollo possono essere applicate ad altri sistemi cellulari come batteri e cellule vegetali6. Il protocollo può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare con accesso a un lettore di micropiastre con modalità fluorescenza, un’apparecchiatura disponibile nella maggior parte degli istituti di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui presentato offre un modo per ottenere informazioni su come le dimensioni globali dell’insieme degli IDR percepiscono e rispondono alle perturbazioni ambientali. Questo metodo si basa su un costrutto geneticamente codificato e non richiede componenti aggiuntivi oltre a un’espressione stabile del plasmide nelle cellule di lievito, il che lo rende adattabile per potenziali applicazioni in altri tipi di cellule. Inoltre, è versatile per esplorare altre perturbazioni fisico-chimiche che le cellule eucariotiche …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Cuevas-Velázquez per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, dalla Dirección General de Asuntos del Personal Académico, dall’Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) numero di progetto IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), progetto numero 252952; e Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) e CAPD (CVU 1269643) riconoscono CONAHCYT per la loro borsa di studio M.Sc.
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
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