Estimation de la sensibilité structurelle de régions intrinsèquement désordonnées en réponse à un stress hyperosmotique dans des cellules vivantes à l’aide de FRET
Summary
Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des domaines protéiques flexibles qui modifient leur conformation en réponse aux changements environnementaux. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence d’ensemble (FRET) peut estimer les dimensions des protéines dans différentes conditions. Nous présentons une approche FRET pour évaluer la sensibilité structurelle de l’IDR dans les cellules vivantes de Saccharomyces cerevisiae sous stress hyperosmotique.
Abstract
Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des domaines protéiques qui participent à des processus cellulaires cruciaux. Dans des conditions de stress, les propriétés physico-chimiques de l’environnement cellulaire changent, ce qui a un impact direct sur l’ensemble conformationnel des IDR. Les bilans approfondis sont intrinsèquement sensibles aux perturbations environnementales. L’étude de la façon dont les propriétés physico-chimiques de la cellule régulent l’ensemble conformationnel des IDR est essentielle pour comprendre le contrôle environnemental de leur fonction. Ici, nous décrivons une méthode étape par étape pour mesurer la sensibilité structurelle des IDR dans les cellules vivantes de Saccharomyces cerevisiae en réponse à des conditions de stress hyperosmotique. Nous présentons l’utilisation du transfert d’énergie par résonance de fluorescence d’ensemble (FRET) pour estimer comment les dimensions globales des IDR changent lors d’une augmentation progressive du stress hyperosmotique imposé aux cellules avec n’importe quel osmolyte. De plus, nous fournissons un script pour traiter les mesures de fluorescence et comparer la sensibilité structurelle pour différents IDR. En suivant cette méthode, les chercheurs peuvent obtenir des informations précieuses sur les changements conformationnels que subissent les IDR dans le milieu intracellulaire complexe lors de changements d’environnement.
Introduction
Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des composants essentiels des processus cellulaires1. En combinaison avec des domaines structurés, les IDR sont essentiels pour les fonctions des protéines. La composition en acides aminés des IDR est biaisée, représentée principalement par des résidus chargés, hydrophiles et petits. En raison de cette propriété, les IDR sont considérés comme des domaines de faible complexité 2,3. De nombreux IDR ont attiré l’attention, principalement parce que ces régions jouent un rôle crucial dans les conditions pathologiques, en particulier les maladies neurodégénératives. Ces maladies sont caractérisées par l’auto-assemblage et le dépôt extracellulaire ou intracellulaire ultérieur de IDR dans les neurones4. Des exemples de tels IDR incluent l’amyloïde-β (Aβ) dans la maladie d’Alzheimer, la huntingtine (HTT) dans la maladie de Huntington, et la protéine de liaison à l’ADN-43 TAR (TDP-43) et fusionnée dans le sarcome (FUS) dans la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale4. L’étude des réarrangements structurels des IDR dans le contexte de la maladie a été considérablement améliorée par des méthodes spectroscopiques, y compris le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET).
La nature hydrophile et étendue des IDR les rend extrêmement sensibles aux changements des propriétés physico-chimiques de l’environnement en solution5. Le degré de modification de l’ensemble conformationnel des IDR par l’environnement est appelé sensibilité structurale 5,6,7. Différentes techniques peuvent être utilisées pour étudier la conformation et la dynamique des IDR, notamment le dichroïsme circulaire (CD) et la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)8,9. Malheureusement, la MC et la SAXS nécessitent de grandes quantités de protéines purifiées, elles ne conviennent donc pas aux études sur les cellules. En revanche, FRET est une technique qui mesure l’intensité de fluorescence de deux molécules fluorescentes qui marquent spécifiquement un IDR, ce qui signifie qu’elles peuvent être surveillées dans des mélanges complexes tels que des cellules vivantes10. La mesure dynamique de la sensibilité structurelle des IDR dans les cellules vivantes est nécessaire pour comprendre comment l’environnement régule la conformation et la fonction du protéome désordonné.
FRET est une méthode puissante pour quantifier la sensibilité structurelle des IDR, ainsi que des protéines globulaires et multidomaines dans les cellules vivantes. La méthode nécessite une construction consistant en un IDR d’intérêt pris en sandwich entre deux protéines fluorescentes (FP), connu sous le nom de paire FRET. Pour ce protocole, nous suggérons l’utilisation de mCerulean3 comme PF donneur et de Citrine comme FP accepteur, en raison de leur large plage dynamique, par rapport à d’autres PF rapportés dans une étude précédente sur la sensibilité des IDR6. FRET a déjà été exploité pour mesurer la sensibilité structurelle d’un IDR végétal dans différents contextes cellulaires6. De plus, cette technique a été utilisée pour caractériser les dimensions protéiques globales des IDR par différents groupes de recherche in vitro et in vivo 5,11.
Ici, nous décrivons la méthode FRET d’ensemble pour étudier la sensibilité structurelle des IDR dans les cellules de levure vivante (Saccharomyces cerevisiae). Nous montrons des résultats représentatifs basés sur une plante IDR appelée AtLEA4-5. AtLEA4-5 est désordonné en solution, mais se replie en hélice α lorsque l’encombrement macromoléculaire est induit in vitro12. AtLEA4-5 est un bon modèle de référence pour cette méthode car il est relativement petit (158 résidus), désordonné et sensible aux perturbations environnementales telles que rapportées in silico et in vitro 6,12. La méthode présentée ici peut être adaptée aux approches à haut débit car les cellules de levure sont faciles à cultiver et le traitement est appliqué en petits volumes. De plus, de petites modifications du protocole peuvent être appliquées à d’autres systèmes cellulaires tels que les bactéries et les cellules végétales6. Le protocole peut être réalisé dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire ayant accès à un lecteur de microplaques en mode fluorescence, un équipement disponible dans la plupart des institutions de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici offre un moyen d’obtenir des informations sur la façon dont les dimensions globales de l’ensemble des IDR perçoivent et réagissent aux perturbations environnementales. Cette méthode repose sur une construction génétiquement codée et ne nécessite aucun composant supplémentaire au-delà d’une expression stable du plasmide dans les cellules de levure, ce qui la rend adaptable à des applications potentielles dans d’autres types de cellules. De plus, il est polyvalent pour explore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Cuevas-Velazquez pour l’examen critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT), projet numéro IA203422 ; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), numéro de projet 252952 ; et Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) et CAPD (CVU 1269643) reconnaissent le CONAHCYT pour leur bourse d’études M.Sc.
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
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