Summary

Estimation de la sensibilité structurelle de régions intrinsèquement désordonnées en réponse à un stress hyperosmotique dans des cellules vivantes à l’aide de FRET

Published: January 12, 2024
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Summary

Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des domaines protéiques flexibles qui modifient leur conformation en réponse aux changements environnementaux. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence d’ensemble (FRET) peut estimer les dimensions des protéines dans différentes conditions. Nous présentons une approche FRET pour évaluer la sensibilité structurelle de l’IDR dans les cellules vivantes de Saccharomyces cerevisiae sous stress hyperosmotique.

Abstract

Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des domaines protéiques qui participent à des processus cellulaires cruciaux. Dans des conditions de stress, les propriétés physico-chimiques de l’environnement cellulaire changent, ce qui a un impact direct sur l’ensemble conformationnel des IDR. Les bilans approfondis sont intrinsèquement sensibles aux perturbations environnementales. L’étude de la façon dont les propriétés physico-chimiques de la cellule régulent l’ensemble conformationnel des IDR est essentielle pour comprendre le contrôle environnemental de leur fonction. Ici, nous décrivons une méthode étape par étape pour mesurer la sensibilité structurelle des IDR dans les cellules vivantes de Saccharomyces cerevisiae en réponse à des conditions de stress hyperosmotique. Nous présentons l’utilisation du transfert d’énergie par résonance de fluorescence d’ensemble (FRET) pour estimer comment les dimensions globales des IDR changent lors d’une augmentation progressive du stress hyperosmotique imposé aux cellules avec n’importe quel osmolyte. De plus, nous fournissons un script pour traiter les mesures de fluorescence et comparer la sensibilité structurelle pour différents IDR. En suivant cette méthode, les chercheurs peuvent obtenir des informations précieuses sur les changements conformationnels que subissent les IDR dans le milieu intracellulaire complexe lors de changements d’environnement.

Introduction

Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des composants essentiels des processus cellulaires1. En combinaison avec des domaines structurés, les IDR sont essentiels pour les fonctions des protéines. La composition en acides aminés des IDR est biaisée, représentée principalement par des résidus chargés, hydrophiles et petits. En raison de cette propriété, les IDR sont considérés comme des domaines de faible complexité 2,3. De nombreux IDR ont attiré l’attention, principalement parce que ces régions jouent un rôle crucial dans les conditions pathologiques, en particulier les maladies neurodégénératives. Ces maladies sont caractérisées par l’auto-assemblage et le dépôt extracellulaire ou intracellulaire ultérieur de IDR dans les neurones4. Des exemples de tels IDR incluent l’amyloïde-β (Aβ) dans la maladie d’Alzheimer, la huntingtine (HTT) dans la maladie de Huntington, et la protéine de liaison à l’ADN-43 TAR (TDP-43) et fusionnée dans le sarcome (FUS) dans la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale4. L’étude des réarrangements structurels des IDR dans le contexte de la maladie a été considérablement améliorée par des méthodes spectroscopiques, y compris le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET).

La nature hydrophile et étendue des IDR les rend extrêmement sensibles aux changements des propriétés physico-chimiques de l’environnement en solution5. Le degré de modification de l’ensemble conformationnel des IDR par l’environnement est appelé sensibilité structurale 5,6,7. Différentes techniques peuvent être utilisées pour étudier la conformation et la dynamique des IDR, notamment le dichroïsme circulaire (CD) et la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)8,9. Malheureusement, la MC et la SAXS nécessitent de grandes quantités de protéines purifiées, elles ne conviennent donc pas aux études sur les cellules. En revanche, FRET est une technique qui mesure l’intensité de fluorescence de deux molécules fluorescentes qui marquent spécifiquement un IDR, ce qui signifie qu’elles peuvent être surveillées dans des mélanges complexes tels que des cellules vivantes10. La mesure dynamique de la sensibilité structurelle des IDR dans les cellules vivantes est nécessaire pour comprendre comment l’environnement régule la conformation et la fonction du protéome désordonné.

FRET est une méthode puissante pour quantifier la sensibilité structurelle des IDR, ainsi que des protéines globulaires et multidomaines dans les cellules vivantes. La méthode nécessite une construction consistant en un IDR d’intérêt pris en sandwich entre deux protéines fluorescentes (FP), connu sous le nom de paire FRET. Pour ce protocole, nous suggérons l’utilisation de mCerulean3 comme PF donneur et de Citrine comme FP accepteur, en raison de leur large plage dynamique, par rapport à d’autres PF rapportés dans une étude précédente sur la sensibilité des IDR6. FRET a déjà été exploité pour mesurer la sensibilité structurelle d’un IDR végétal dans différents contextes cellulaires6. De plus, cette technique a été utilisée pour caractériser les dimensions protéiques globales des IDR par différents groupes de recherche in vitro et in vivo 5,11.

Ici, nous décrivons la méthode FRET d’ensemble pour étudier la sensibilité structurelle des IDR dans les cellules de levure vivante (Saccharomyces cerevisiae). Nous montrons des résultats représentatifs basés sur une plante IDR appelée AtLEA4-5. AtLEA4-5 est désordonné en solution, mais se replie en hélice α lorsque l’encombrement macromoléculaire est induit in vitro12. AtLEA4-5 est un bon modèle de référence pour cette méthode car il est relativement petit (158 résidus), désordonné et sensible aux perturbations environnementales telles que rapportées in silico et in vitro 6,12. La méthode présentée ici peut être adaptée aux approches à haut débit car les cellules de levure sont faciles à cultiver et le traitement est appliqué en petits volumes. De plus, de petites modifications du protocole peuvent être appliquées à d’autres systèmes cellulaires tels que les bactéries et les cellules végétales6. Le protocole peut être réalisé dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire ayant accès à un lecteur de microplaques en mode fluorescence, un équipement disponible dans la plupart des institutions de recherche.

Protocol

1. Construction plasmidique Amplifiez le cadre de lecture ouvert (ORF) qui code pour l’IDR souhaité par réaction en chaîne par polymérase (PCR). N’incluez pas le codon stop car l’ORF sera flanqué des gènes qui codent pour les protéines fluorescentes. Pour l’amplification, concevez des amorces avec les sites de restriction SacI (5′) et BglII (3′).NOTE : Pour la section des résultats représentatifs, nous avons utilisé AtLEA4-5 comme IDR sélectionné. Nous avons amplifié l’ORF d’AtLEA4-5 à partir du plasmide pTrc99A-AtLEA4-512. Digérer le produit de PCR ORF par restriction consécutive avec les enzymes SacI et BglII13. Obtenir le plasmide commercial pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) auprès d’Addgene (https://www.addgene.org/178189/). Effectuer une restriction consécutive à l’aide des enzymes SacI et BglII pour éliminer l’ORF AtLEA4-5 du plasmide pDRFLIP38-AtLEA4-5, laissant un plasmide ouvert contenant la paire FRET13. Purifier les fragments d’ADN digérés en utilisant la récupération de gel à partir d’une électrophorèsesur gel d’agarose 14. Lister les fragments restreints à l’aide de l’ADN ligase15. Transformer la réaction de clonage en cellules Escherichia coli compétentes (DH5α ou souches apparentées) et sélectionner dans des plaques Luria-Bertani (LB) contenant 50 μg/mL d’ampicilline16. Cultiver toute la nuit (ON) à 37 °C. Isoler et cultiver au moins cinq colonies transformées dans une nouvelle plaque et génotyper par PCR17. Purifier l’ADN plasmidique d’une colonie transformée positive en utilisant les méthodes miniprep standard18. Vérifier l’extraction et l’intégrité de l’ADN plasmidique à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose19. Vérifiez le clonage correct de la construction à l’aide du séquençage de Sanger20. 2. Expression plasmidique dans les cellules de levure REMARQUE : Utilisez des techniques aseptiques standard pour effectuer les étapes suivantes. Utilisez une hotte à flux laminaire de culture ou un briquet. Inoculer une souche de S. cerevisiae BJ5465 (ATCC : 208289) dans 3 mL de milieu de dextrose peptoné de levure (YPD) et faire croître à 30 °C et 200 tr/min.REMARQUE : BJ5465 est une souche déficiente en protéase (CH1) recommandée pour travailler avec des IDR. D’autres souches de S. cerevisiae peuvent être testées et utilisées. Centrifuger 1 mL de culture de levure saturée pendant la nuit (OD600 ~ 3-4) à 14 000 x g pendant 1 min. Retirez délicatement le surnageant par pipetage. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon Tris-EDTA (TE) (pH 7,5) en agitant doucement le tube. Centrifuger à 14 000 x g pendant 1 min et retirer délicatement le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon Lazy Bones (40 % p/v PEG 3 350 ; 100 mM d’acétate de lithium ; 10 mM de Tris-HCl ; 1 mM d’EDTA ; pH 7,5) par pipetage. Ajouter 25 μL d’ADN de spermatozoïdes de saumon bouilli (100 °C pendant 5 min, puis refroidi sur glace pendant 5 min) (2 mg/mL) aux cellules de levure remises en suspension. Ajoutez 100 ng d’ADN plasmidique au mélange et agitez le mélange pendant 1 min pour assurer un mélange complet. Laisser reposer le mélange à température ambiante pendant 1 à 2 h. Secouez le mélange de levure à 42 °C pendant 12 min, puis laissez refroidir sur de la glace pendant 12 minutes supplémentaires. Centrifuger le tube à 14 000 x g pendant 1 min et retirer délicatement le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon TE (pH 7,5). Plaque de 100 μL de cellules transformées sur des plaques de levure Milieu synthétique sans uracile (SD-ura) complétée par 15 g/L de gélose. Incuber les plaques à 30 °C pendant 2 à 3 jours (figure 1). Striez au moins cinq transformants de levure dans une nouvelle assiette et poussez. 3. Validation des transformants de levure Prélever une petite portion de chaque candidat transformant en grattant doucement et en remettant en suspension dans 5 μL de NaOH 20 mM dans des tubes de PCR individuels. Chauffer l’échantillon à 99 °C pendant 10 min dans un thermocycleur pour lyser les cellules et libérer l’ADN dans la solution. Cette étape est cruciale pour préparer le modèle d’ADN pour la PCR. Transférer 1 μL de l’échantillon bouilli dans un mélange de réaction PCR séparé contenant les amorces et les réactifs PCR appropriés pour le génotypage. Nous avons utilisé les amorces suivantes : Amorce avant : 5′-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3′. Amorce inversée : 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3′. Mettre en place une réaction PCR et valider la présence du bon plasmide à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Sélectionnez un transformant pour d’autres expériences. 4. Préparation de la culture de cellules de levure pour le test FRET Inoculer une striure du transformant de levure sélectionné dans 3 mL de milieu liquide 1x SD-Ura.REMARQUE : Effectuez cette procédure dans une hotte à flux laminaire et un matériau stérile. Cultiver à 30 °C, 200 tr/min pendant au moins 12 h pour atteindre la saturation. Mesurez le diamètre extérieur600. La croissance devrait se situer entre600 DO = 1,0-2,0.REMARQUE : Si la DO600 est inférieure à 1,0, donnez aux cellules plus de temps d’incubation pour se développer. Si OD600 dépasse 2.0, ne continuez pas et recommencez à partir de l’étape 4.1. 5. Préparation de cellules de levure pour le test FRET Prélever 2 mL de la culture de levure pendant la nuit et centrifuger à 14 000 x g à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant par pipetage. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de 50 mM de tampon d’acide éthanesulfonique (MES) 2-(N-morpholino) (pH 6). Centrifuger à 14 000 x g à température ambiante. Retirez le surnageant. Répétez les étapes 5.2 et 5.3. Remettre les cellules de levure en suspension dans 2 mL de tampon MES, pH 6 et verser le volume dans un réservoir de réactif. 6. Mise en place des mesures de fluorescence REMARQUE : Le présent balayage est considéré comme effectué dans un lecteur de microplaques en mode fluorescence. Pour les réglages de base, réglez l’instrument comme suit : Type de mesure : Spectre d’intensité de fluorescence (FI) ; Nom de la microplaque : Greiner 96 F-bottom. Pour les réglages optiques, réglez l’instrument comme suit : Non. de points de balayage de longueur d’onde : 91 ; Longueur d’onde d’excitation : 433 nm ; Bande passante d’excitation : 10 nm ; Longueur d’onde d’émission : 460 – 550 ; Largeur de marche : 1 nm ; Largeur de bande d’émission : 10 nm ; Hauteur focale obtenue par autofocus ; Hauteur focale : 5 mm ; Longueur d’onde utilisée pour le gain : 490 nm. Pour les réglages généraux, réglez l’instrument comme suit : Temps de stabilisation : 0,1 s ; Sens de lecture : unidirectionnel, horizontal de gauche à droite, de haut en bas.REMARQUE : Le gain saisi manuellement doit être ajusté pour chaque mesure à l’aide du puits prévu pour afficher les niveaux d’intensité de fluorescence les plus élevés tout au long du balayage de longueur d’onde. 7. Préparation des solutions hypertoniques et mesures de fluorescence Préparer des solutions de NaCl 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1 M, 1,5 M et 2 M dans une plaque noire à fond transparent à 96 puits. Le volume final dans chaque puits sera de 200 μL (150 μL de solution osmolytique + 50 μL de suspension de cellules de levure).REMARQUE : D’autres osmolytes peuvent être utilisés pour induire un stress hyperosmotique. Toutes les solutions doivent être préparées dans un tampon MES de 50 mM pH 6. Chargez 150 μL de tampon MES de 50 mM, pH 6 dans les trois premiers puits de la rangée A (A1, A2, A3) et dans les puits suivants, ajoutez 150 μL de la solution correspondante dans l’ordre croissant de gauche à droite (figure 2). Pour tester toutes les concentrations suggérées, continuez le chargement dans la rangée B.REMARQUE : Ce paramètre prend en compte les mesures de 3 répétitions techniques pour chaque concentration. À l’aide d’une micropipette à 12 canaux, transférer 50 μL de cellules de levure lavées dans chaque puits. Les cellules de levure ont tendance à sédimenter au fond du réservoir. Assurez-vous de bien remettre en suspension la suspension de levure en pipetant de haut en bas avant de transférer les cellules. Chargez les cellules dans la plaque de 96 puits contenant les différentes solutions et mélangez bien en pipetant de haut en bas au moins 4 fois. Mesurez immédiatement les spectres d’émission d’intensité de fluorescence pour les puits souhaités dans un lecteur de microplaques avec les paramètres de spécification de l’étape 6. Répétez la procédure pour chaque IDR à tester dans le test FRET. Étape facultative. Si possible, mesurez une construction de donneur uniquement (pDRFLIP38-mCerulean3) en suivant les étapes décrites ici.REMARQUE : Nous vous recommandons d’effectuer cette étape pour calculer l’efficacité FRET de chaque condition. Si le lecteur ne peut pas effectuer cette étape, FRET peut être calculé à l’aide de la méthode du ratio FRET. Les deux méthodes de calcul FRET sont expliquées aux étapes 8 et 9. Effectuez au moins trois répétitions sur trois jours indépendants pour chaque construction. 8. Traitement des données selon la méthode d’efficacité FRET REMARQUE : Pour les lecteurs connaissant le langage de programmation R, nous fournissons un ensemble de scripts R pour effectuer le traitement des données décrit dans cette section. Les scripts peuvent être trouvés à https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Suivez les instructions du fichier README. Exportez les données sous forme de fichiers .xlsx à partir du lecteur de microplaques. Normalisez les valeurs d’intensité de fluorescence à chaque longueur d’onde de balayage au point isobestique de la paire FRET utilisée.NOTE : Cette étape est nécessaire pour comparer les spectres de toutes les conditions testées. Le point isosbestique de la paire mCerulean3 et Citrine FRET est de 515 nm. Par exemple, obtenez le rapport des valeurs d’intensité de fluorescence de 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm, etc. Calculez la moyenne pour chaque répétition technique une fois les valeurs de fluorescence normalisées. Au total, il devrait y avoir une colonne pour chaque condition de stress hyperosmotique. Visualisez tous les spectres d’intensité de fluorescence dans le même graphique (Figure 3). Chaque spectre doit présenter une combinaison des spectres d’émission de fluorescence de mCerulean3 et de Citrine individuels. Dans de rares cas, lorsque l’efficacité FRET est de 0, seul le spectre d’émission de fluorescence du donneur sera observé, ou lorsque l’efficacité FRET est de 1, seule la fluorescence de l’accepteur sera observée. Le pic d’émission de fluorescence pour mCerulean3 (donneur) est de 475 nm, et le pic d’émission de fluorescence pour la citrine (accepteur) est de 525 nm. Déterminez si la mesure de fluorescence présente un changement FRET typique en réponse à un stress hyperosmotique. Si la conformation de l’IDR est sensible au traitement, cela se traduira par un changement dans l’efficacité du FRET. Un changement typique de l’efficacité du FRET couplera une diminution de l’intensité de fluorescence du donneur à une augmentation de l’intensité de fluorescence de l’accepteur ou vice versa. Quantifier l’efficacité FRET (EFRET). Obtenir les valeurs de pic normalisées du donneur (mCerulean3) (475 nm/515 nm) pour la construction IDR et la construction donneur uniquement pour chaque condition de stress hyperosmotique. Utilisez les valeurs de crête normalisées moyennes des répétitions techniques. Effectuez cette opération pour chacune des trois répliques indépendantes. Calculez EFRET avec la formule suivante :Où IDA est le rapport 475 nm/515 nm de la construction IDR (construction de paire FRET), et ID est le rapport 475 nm/515 nm de la construction donneur uniquement. Comparez l’efficacité FRET. Normalisez les valeursFRET E de chaque condition de stress hyperosmotique à laFRET E de la condition de non-stress (par exemple, 0 M NaCl). Faites des comparaisons à l’aide d’une boîte à moustaches ou d’une courbe lisse. Effectuer une ANOVA à un facteur suivie d’un test statistique de Tukey post-hoc (valeurs p : *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). 9. Traitement des données selon la méthode du rapport FRET REMARQUE : Si les mesures du donneur uniquement ne peuvent pas être acquises, effectuez la méthode du rapport FRET. Cette méthode compare le rapport FRET dans différentes conditions de stress hyperosmotique. Les étapes 7.1 à 7.5 doivent être effectuées avant les étapes de cette section pour valider un comportement FRET typique. Pour les lecteurs connaissant le langage de programmation R, nous fournissons un ensemble de scripts R pour effectuer le traitement des données décrit dans cette section. Les scripts peuvent être trouvés à https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Suivez les instructions du fichier README. Extrayez les données à 475 nm et 525 nm du fichier xlsx précédemment exporté depuis le lecteur de microplaques. Ces valeurs correspondent au pic d’émission de fluorescence pour mCerulean3 (donneur, DxDm) et au pic d’émission de fluorescence pour la Citrine (accepteur, DxAm) lorsque le fluorophore donneur est excité (433 nm). Normaliser les valeurs d’intensité de fluorescence à 475 nm et 525 nm au point isobestique de la paire FRET utilisée. Le point isosbestique de la paire mCerulean3 et Citrine FRET est de 515 nm. Obtenir le rapport FRET (DxAm/DxDm). Comparez les ratios FRET. Normalisez les valeurs DxAm/DxDm de chaque condition de stress hyperosmotique à la moyenne DxAm/DxDm de la condition de non-stress (par exemple, 0 M NaCl). Faites des comparaisons à l’aide d’une boîte à moustaches ou d’une courbe lisse (Figure 4 et Figure 5). Effectuer une ANOVA à un facteur suivie d’un test statistique de Tukey post-hoc (valeurs p : *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Representative Results

Après transformation de cellules de levure avec le plasmide pDRFLIP38-AtLEA4-5, la fluorescence des transformants positifs a été observée avec un transilluminateur à lumière bleue et un filtre (Figure 1). La préparation des différentes solutions pour induire un stress hyperosmotique prend du temps, nous vous suggérons donc de suivre le modèle à 96 puits de la figure 2. Immédiatement après le traitement de stress hyperosmotique avec des concentration…

Discussion

La méthode présentée ici offre un moyen d’obtenir des informations sur la façon dont les dimensions globales de l’ensemble des IDR perçoivent et réagissent aux perturbations environnementales. Cette méthode repose sur une construction génétiquement codée et ne nécessite aucun composant supplémentaire au-delà d’une expression stable du plasmide dans les cellules de levure, ce qui la rend adaptable à des applications potentielles dans d’autres types de cellules. De plus, il est polyvalent pour explore…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du laboratoire Cuevas-Velazquez pour l’examen critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT), projet numéro IA203422 ; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), numéro de projet 252952 ; et Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) et CAPD (CVU 1269643) reconnaissent le CONAHCYT pour leur bourse d’études M.Sc.

Materials

96-well plate Greiner Bio-One 655096
Agar Sigma-Aldrich 5040
BglII New England BioLabs R0144S
BJ5465 cells American Type Culture Collection 208289
Buffer MES 50 mM Sigma-Aldrich M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM Invitrogen 15506017
EDTA 1 mM Merck 108452
Falcon tubes Corning 352057
LB media Sigma-Aldrich L2897
Lithium acetate 0.1 M Sigma-Aldrich L6883
Low Melt Agarose GOLDBIO A-204-25
Microcentrifuge eppendorf 5452000010
Miniprep kit ZymoPure D4210
NaOH 0.02 M Merck 106462
PEG 3,350 40% Sigma-Aldrich 1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 addgene 178189
Plate reader BMG LABTECH CLARIOstar Plus
SacI New England BioLabs R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL Thermo Fisher Scientific 15632011
SD-Ura Sigma-Aldrich Y1501
Sodium cloride Sigma-Aldrich S9888
Taq polymesare Promega M5123
Transiluminator Accuris instruments E4000
UV-Visible spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate3
YPD media Sigma-Aldrich Y1500

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Citer Cet Article
Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. A., Cuevas-Velazquez, C. L. Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET. J. Vis. Exp. (203), e66275, doi:10.3791/66275 (2024).

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