הערכת רגישות מבנית של אזורים לא מסודרים במהותם בתגובה לעקה היפראוסמוטית בתאים חיים באמצעות FRET
Summary
אזורים לא מסודרים מהותיים (IDR) הם תחומי חלבון גמישים המשנים את הקונפורמציה שלהם בתגובה לשינויים סביבתיים. Ensemble Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) יכול להעריך את ממדי החלבונים בתנאים שונים. אנו מציגים גישת FRET להערכת רגישות מבנית IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים תחת לחץ היפראוסמוטי.
Abstract
אזורים בעלי הפרעה פנימית (IDR) הם תחומים חלבוניים המשתתפים בתהליכים תאיים חיוניים. במהלך תנאי עקה, התכונות הפיזיקוכימיות של הסביבה התאית משתנות, ומשפיעות ישירות על ההרכב הקונפורמטיבי של IDRs. IDR רגישים מטבעם להפרעות סביבתיות. חקר האופן שבו התכונות הפיזיקוכימיות של התא מווסתות את ההרכב הקונפורמטיבי של IDR חיוני להבנת הבקרה הסביבתית של תפקודם. במאמר זה אנו מתארים שיטה שלב אחר שלב למדידת הרגישות המבנית של IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים בתגובה לתנאי עקה היפראוסמוטיים. אנו מציגים את השימוש בהעברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי להעריך כיצד הממדים הגלובליים של IDR משתנים במהלך עלייה הדרגתית של לחץ היפראוסמוטי המוטל על תאים עם אוסמוליט כלשהו. בנוסף, אנו מספקים סקריפט לעיבוד מדידות פלואורסצנטיות והשוואת רגישות מבנית עבור IDR שונים. על ידי ביצוע שיטה זו, חוקרים יכולים לקבל תובנות חשובות לגבי השינויים הקונפורמטיביים שעוברים IDR בסביבה התוך-תאית המורכבת בסביבות משתנות.
Introduction
אזורים בעלי אי-סדר פנימי (IDR) הם מרכיבים קריטיים בתהליכים תאיים1. בשילוב עם תחומים מובנים, IDR חיוניים לתפקודי חלבון. הרכב חומצות האמינו של IDR מוטה, ומיוצג בעיקר על ידי שאריות טעונות, הידרופיליות וקטנות. בגלל מאפיין זה, IDR נחשבים לתחומים בעלי מורכבות נמוכה 2,3. IDR רבים משכו תשומת לב, בעיקר משום שאזורים אלה ממלאים תפקיד מכריע במצבים פתולוגיים, במיוחד מחלות נוירודגנרטיביות. מחלות כאלה מאופיינות על ידי הרכבה עצמית ולאחר מכן תצהיר חוץ תאי או תוך תאי של IDR בנוירונים4. דוגמאות ל-IDR כאלה כוללות β עמילואיד (Aβ) במחלת אלצהיימר, הנטינגטין (HTT) במחלת הנטינגטון, וחלבון קושר דנ”א-TAR -43 (TDP-43) והתמזגו בסרקומה (FUS) בטרשת אמיוטרופית צידית ודמנציה פרונטוטמפורלית4. המחקר של סידורים מבניים מחדש של IDR בהקשר של מחלה השתפר באופן משמעותי על ידי שיטות ספקטרוסקופיות, כולל העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET).
האופי ההידרופילי והמורחב של IDR הופך אותם לרגישים ביותר לשינויים בתכונות הפיזיקוכימיות של סביבת התמיסה5. המידה שבה ההרכב הקונפורמטיבי של IDR משתנה על ידי הסביבה נקראת רגישות מבנית 5,6,7. ניתן להשתמש בטכניקות שונות כדי לחקור את הקונפורמציה והדינמיקה של IDR, כולל דיכרואיזם מעגלי (CD) ופיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS)8,9. למרבה הצער, CD ו- SAXS דורשים כמויות גדולות של חלבונים מטוהרים, ולכן הם אינם מתאימים למחקרים בתאים. לעומת זאת, FRET היא טכניקה המודדת את עוצמת הפלואורסצנטיות של שתי מולקולות פלואורסצנטיות המסמנות באופן ספציפי IDR אחד, כלומר ניתן לנטר אותן בתערובות מורכבות כגון תאים חיים10. מדידה דינמית של הרגישות המבנית של IDR בתאים חיים נחוצה להבנת האופן שבו הסביבה מווסתת את הקונפורמציה והתפקוד של הפרוטאום הלא מסודר.
FRET היא שיטה רבת עוצמה לכימות הרגישות המבנית של IDRs, כמו גם חלבונים כדוריים ורב-תחומיים בתאים חיים. השיטה דורשת מבנה המורכב מ-IDR של עניין הדחוק בין שני חלבונים פלואורסצנטיים (FP), המכונה זוג FET. עבור פרוטוקול זה, אנו מציעים להשתמש ב- mCerulean3 כ- FP התורם ובסיטרין כ- FP המקבל, בגלל הטווח הדינמי הגדול שלהם, בהשוואה ל- FPs אחרים שדווחו במחקר קודם על רגישות IDR6. FRET נוצל בעבר למדידת הרגישות המבנית של צמח בהקשרים תאיים שונים6. בנוסף, טכניקה זו שימשה לאפיון ממדי החלבון הכוללים של IDR על ידי קבוצות מחקר שונות הן in vitro והן in vivo 5,11.
במאמר זה נתאר את שיטת FRET לחקר הרגישות המבנית של IDR בתאי שמרים חיים (Saccharomyces cerevisiae). אנו מציגים תוצאות מייצגות המבוססות על מפעל IDR בשם AtLEA4-5. AtLEA4-5 אינו מסודר בתמיסה, אך מתקפל לתוך סליל α כאשר נוצרת צפיפות מקרומולקולרית במבחנה12. AtLEA4-5 הוא מודל ייחוס טוב לשיטה זו מכיוון שהוא קטן יחסית (158 שאריות), לא מסודר ורגיש להפרעות סביבתיות כפי שדווח בסיליקו ובמבחנה 6,12. השיטה המוצגת כאן ניתנת להרחבה עבור גישות תפוקה גבוהה מכיוון שקל לגדל תאי שמרים, והטיפול מיושם בכמויות קטנות. בנוסף, שינויים קטנים בפרוטוקול יכולים להיות מיושמים על מערכות תאיות אחרות כגון חיידקים ותאי צמח6. הפרוטוקול יכול להתבצע בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית עם גישה לקורא מיקרו-צלחות עם מצב פלואורסצנטי, ציוד הזמין ברוב מוסדות המחקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת כאן מציעה דרך לקבל תובנות כיצד הממדים הגלובליים של אנסמבל ה- IDR חשים ומגיבים להפרעות סביבתיות. שיטה זו מסתמכת על מבנה מקודד גנטית ואינה דורשת רכיבים נוספים מעבר לביטוי יציב של פלסמיד בתאי שמרים, מה שהופך אותה לניתנת להתאמה ליישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים. יתר על כן, הוא ר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת Cuevas-Velazquez על הסקירה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) פרויקט מספר IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), פרויקט מספר 252952; ו- Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) ו- CAPD (CVU 1269643) מודים ל- CONAHCYT על מלגת M.Sc שלהם.
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
References
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
- Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
- Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
- Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
- Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
- Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
- Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
- Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
- Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
- Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
- Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
- Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
- JoVE Science Education Database. . Restriction enzyme digests. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Gel purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA ligation reactions. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Plasmid purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA gel electrophoresis. , (2023).
- JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides – Concept Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023)
- Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
- Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
- Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
- Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
- Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
- Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
- Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
- Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
- Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
- Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).
