여기에서는 쥐 눈의 전방에 생착된 간 스페로이드의 비침습적 in vivo 이미징을 허용하는 플랫폼에 대해 설명합니다. 워크플로우는 일차 간 세포에서 스페로이드를 생성하는 것부터 마우스 눈에 이식하고 컨포칼 현미경을 통해 세포 해상도로 생체 내 이미징을 수행하는 것까지 다양합니다.
포유류의 간에 대한 생물의학 연구는 세포 해상도에서 생체 내 비침습적 종단 이미징을 위한 방법의 부족으로 인해 방해를 받고 있습니다. 지금까지는 세포 수준에서 고해상도 이미징을 제공하는 생체 내 이미징을 통해 간의 현장 광학 이미징이 가능했지만 여러 번 수행할 수 없으므로 동일한 동물에서 종방향으로 수행할 수 없었습니다. 생물 발광(bioluminescence)과 같은 비침습적 이미징 방법은 동일한 동물에 대한 반복적인 이미징 세션을 허용하지만 세포 해상도를 달성하지는 못합니다. 이러한 방법론의 차이를 해결하기 위해 우리는 쥐 눈의 전방에 생착된 간 스페로이드의 비침습적 in vivo 이미징을 위한 플랫폼을 개발했습니다. 이 연구에서 설명된 워크플로우에서 1차 마우스 간 스페로이드는 시험관에서 생성되어 수혜자 마우스의 눈 전방에 이식되어 홍채에 생착됩니다. 각막은 기존의 컨포칼 현미경으로 생착된 스페로이드를 이미지화할 수 있는 자연스러운 신체 창 역할을 합니다. 스페로이드는 눈에서 수개월 동안 생존하며, 이 기간 동안 세포는 건강 및 질병의 맥락에서 연구될 수 있을 뿐만 아니라 적절한 형광 프로브를 사용하여 반복적인 이미징 세션을 통해 다양한 자극에 대한 반응으로 모니터링될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 이 이미징 시스템을 구현하는 데 필요한 단계를 분석하고 그 잠재력을 가장 잘 활용하는 방법을 설명합니다.
건강 및 질병 중 포유류의 간 기능 모니터링은 고해상도, 비침습적 생체 내 이미징 기술의 부족으로 인해 제한됩니다. 이 장기의 시각화는 접근할 수 없는 위치로 인해 방해를 받고 있으며, 세포 과정을 결합하기 위해 생체 내 연구는 서로 다른 시점에서 동물의 희생에 의존합니다. 이러한 이미징 제한을 피하기 위해 많은 작업이 통제된 환경에서 간과 같은 미세 조직을 시각화하고 연구하는 체외 모델에 의존하고 있습니다.
최근 몇 년 동안 간 스페로이드와 같은 3차원 배양 시스템의 개발은 간 연구를 지원하고 발전시켰습니다. 간 스페로이드는 간 조직의 미세환경과 복잡한 세포-세포 상호작용을어느 정도 모방하는 다세포 응집체이며1 기존의 단층 배양에 비해 분명한 이점을 제공합니다 2,3. 간 스페로이드는 또한 다양한 간 질환 4,5,6에 대한 모델로 사용되며 질병 메커니즘을 이해하는 데 중요한 역할을 합니다. 그럼에도 불구하고 현재 in vitro liver 모델의 주요 한계는 생리학적 in vivo 환경이 부족하고 배양에서의 활용 시간이 제한적(약 20일)이라는 것입니다3. 간 스페로이드는 이전에 생체 내 다른 부위, 예를 들어 신장 캡슐(kidney capsule)7 아래 또는 복강 내(intraperitoneally)8와 같은 다른 부위에 이식되었는데, 이는 광학 이미징을 위해 접근할 수 없다. 생체 내 간 이미징은 세포 해상도 실시간 이미징을 제공하는 최첨단 기술입니다. 현재 이러한 상피내 간 영상은 외부 장기에서만 가능하며, 이는 매우 침습적이며 종종말기 9입니다. 복부 창문을 삽입하면 반복적인 간 영상 촬영이 가능하지만 복잡한 수술과 사후 관리가 수반됩니다.
세포 해상도에서 종단 모니터링을 수행하기 위해 간 스페로이드를 생쥐의 안구 전방(ACE)에 이식하는 방법을 조사했으며, 여기서 간과 유사한 조직이 생리학적 환경에 생착되고 신체 자극에 연결되어 광학 이미징에 접근할 수 있습니다. 각막은 투명한 조직이며 홍채에 생착된 미세조직을 컨포칼 현미경으로 비침습적 및 종방향으로 이미징할 수 있는 창 역할을 합니다. 여기에서는 간 스페로이드10의 in vivo 이미징을 위해 새로 개발된 이 플랫폼의 워크플로우를 제시합니다. 이 프로토콜은 (1) 1차 마우스 간 세포 추출 및 간 스페로이드의 시험관 내 형성, (2) 간 스페로이드를 수혜 마우스의 ACE에 이식, (3) 마취된 마우스에서 생착된 간 스페로이드의 in vivo 이미징으로 나뉘며 구현을 위한 단계별 가이드입니다. 또한 이 이미징 플랫폼의 몇 가지 가능성과 응용 분야를 선보일 것입니다.
이 프로토콜은 ACE에 생착된 간 스페로이드의 안구 내 이미징을 위한 새로운 플랫폼을 설명합니다. ACE는 혈관, 신경 및 산소가 풍부한 독특한 생착 미세환경과 각막을 통한 이미징에 대한 접근성으로 인해 이전에 췌장 섬11,12과 같은 다른 장기 유래 미세조직의 이식 장소로 사용되었습니다. 생체 내 간 이미징을 통해 세포와 과정을 현장에서 시각화할 수 있지만 종단 모니터링은 불가능합니다. 복부 창문을 통한 간 영상 촬영은 복잡한 수술을 수반하며, 신체 내 장기의 움직임으로 인해 시간 경과에 따른 단세포 추적이 어렵습니다. 따라서 이 새로운 이미징 방법은 단일 세포 해상도에서 간 세포의 비침습적 종단 모니터링을 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다. 첫 번째는 Charni-Natan et al.13에서 채택한 2단계 콜라겐분해효소 관류를 통한 원발성 간세포의 분리로, 마취된 살아있는 동물 대신 죽은 쥐에 대해 간 관류를 수행한다는 차이점이 있습니다. 이러한 변화는 윤리적 고려 사항이 적고 유기체에서 마취 잔류물을 피하는 것과 같은 특정 이점을 제공합니다. 이 연구에서는 분리물의 간세포가 풍부한 부분에서 간 스페로이드를 생성하지만, 이는 다양한 조성의 공동 배양 스페로이드를 만들기 위해 다른 특수 프로토콜을 사용하여 다른 비실질 세포 집단을 분리할 가능성을 배제하지 않습니다14,15.
이 프로토콜의 두 번째 부분은 간 스페로이드를 수용 마우스의 ACE에 이식하는 것입니다. 이것은 마취된 마우스에서 수행되는 빠르고 간단한 수술(10분 미만)이며 수술 후 치료가 필요하지 않습니다. 각막 천자는 자가 밀봉되고 3-5일에 걸쳐 치유됩니다. 간혹 치유 과정에서 절개 부위 주변에 약간의 흐릿함이 관찰되지만 며칠 내에 사라집니다. 우리는 수술받은 동물의 눈에 전방 활막증이 나타난 사례를 경험하지 못했습니다. 우리는 깨끗하지만 개방된 실험실에서 이식 절차를 수행하며 수술한 눈의 감염 문제 없이 수행합니다. 눈에 스페로이드를 접종하고 생착하는 것은 시력을 손상시키거나 수용 동물의 행동을 변화시키지 않습니다. 이 프로토콜에서는 이식 수술과 생체 내 이미징 모두에 이소플루란 마취를 사용하며, 이는 마우스에서 잘 견디는 것입니다. 용량 의존적 효과로 인해 절차 전반에 걸쳐 쉽게 조정할 수 있으며 수면 및 기상 시간을 줄이는 이점을 제공합니다. 그러나 대체 주사 가능한 마취제를 사용할 수 있습니다. 이식 후, 일반적으로 스페로이드가 완전히 생착되고, 혈관화되고, 신경 분포가 형성될 때까지 1개월을 허용한 후 치료 중재 및 생체 내 이미징을 수행합니다. 또한 인간 간 스페로이드와 면역력이 저하된 수용 마우스를 사용하여 이식 및 생착이 가능하다는 것을 보여주었다10.
이 방법의 세 번째 부분은 ACE에서 생착된 간 스페로이드의 in vivo 이미징입니다. 이 프로토콜은 연구 이미징 시설에서 흔히 볼 수 있는 현미경 장비를 사용하는 in vivo 이미징 설정을 설명합니다. 더욱이, 마우스 헤드 홀더 및 플라스틱 캐뉼라와 같은 특수 재료는 현재 상업적으로 이용 가능합니다. 이 이미징 설정을 통해 z 절편을 캡처하고 레이저 침투 깊이와 형광 검출 깊이에 따라 스페로이드 구조의 3차원 재구성을 얻을 수 있습니다. 생착된 간 스페로이드에서 세포 기능을 모니터링하려면 세포 유형, 세포 기능 및 역학을 보고하는 형광 단백질의 시각화에 의존합니다. 따라서, 이 이미징 플랫폼은 단독으로 또는 조합하여 다양한 양식을 사용하여 활용될 수 있습니다: (1) 형광 프로브는 정맥 주사로 투여될 수 있습니다(예: 기능성 염료뿐만 아니라 세포를 라벨링하고 추적하기 위한 항체); (2) 간 스페로이드는 간 특이적 형광 단백질을 발현하는 리포터 마우스 모델로부터 분리된 세포로부터 생성될 수 있습니다(예: 세포주기 역학에 대해 보고하는 FUCCI 간 스페로이드; (3) 시험관 내에서 간 스페로이드의 형성은 transfection 또는 transduction과 결합하여 스페로이드에 형광 단백질 및 바이오센서를 장착할 수 있습니다. 예: 아데노 관련 바이러스. 실험 설정에서 excitation을 위해 단일 광자를 사용하여 달성할 수 있는 이미징 깊이는 대략 60-100 μm입니다. 그러나 이는 레이저 출력 및 다광자 이미징 가용성, 형광 프로브 방출 특성 및 검출기의 감도, 스페로이드가 생착되는 눈의 각도에 따라 달라집니다. 이미징 획득 후 Image J 및 Imaris와 같은 인기 있는 프로그램을 사용하여 다운스트림 이미지 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, FUCCI 리포터의 경우, 녹색으로 표시된 세포주기 활성 세포를 계수하고 총 적색 세포의 수와 대조하여 생착된 스페로이드 내의 세포 주기 활성을 평가할 수 있습니다. 또한 ACE 이미징 플랫폼을 사용하면 물질을 눈에 적용하거나(점안액 형태) ACE에 직접 주입하여 이식편을 치료하고 반응을 모니터링할 수 있습니다. 사후 이식된 스페로이드는 수동 미세해부로 쉽게 회수할 수 있으며 면역형광 염색, 전사체 분석 등과 같은 생체 외 기술을 통해 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.10.
이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫 번째는 우리의 경험에 비추어 볼 때, 수혜 마우스는 알비노, 즉 색소가 없는 홍채를 가져야 한다는 것입니다. 생착 시 간 스페로이드는 홍채 세포의 단층으로 덮여 스페로이드의 생존력이나 기능에 영향을 미치지 않지만 홍채 세포의 색소는 이미징을 방해합니다. 두 번째 고려 사항은 마취된 마우스에서 안구 내 이미징 중 안정성입니다. in vivo 이미징 세션 중에는 동물의 마취 농도와 호흡을 면밀히 모니터링하여 움직임을 최소화해야 합니다. 그럼에도 불구하고 여기에 표시된 이미징 설정을 사용하여 단일 셀 수준에서 고해상도 이미징을 얻을 수 있습니다.
요약하자면, 이 프로토콜은 생쥐의 눈에 생착된 간 유사 조직의 비침습적 in vivo 이미징 플랫폼의 구현을 설명합니다. 우리는 쉬운 절차, 공통 장비 및 저렴한 재료를 사용하여 많은 조사관이 달성할 수 있는 접근 방식을 만듭니다. 이 모델은 in vitro 3D 간 스페로이드의 장점과 ACE가 제공하는 in vivo 환경 및 광학 접근성을 결합하여 기초 연구 및 전임상 환경에서 간 생리학 및 병리학을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 만듭니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 스웨덴 당뇨병 협회(Swedish Diabetes Association), 카롤린스카 연구소(Karolinska Institutet) 기금, 스웨덴 연구 위원회(Swedish Research Council), 노보 노디스크 재단(Novo Nordisk Foundation), 패밀리 얼링-페르손 재단(Family Erling-Persson Foundation), 카롤린스카 연구소(Karolinska Institutet)의 당뇨병 전략 연구 프로그램(Strategic Research Program in Diabetes at Karolinska Institutet), 패밀리 크누트 & 앨리스 발렌베리 재단(The Family Knut and Alice Wallenberg Foundation), 요나스 & 크리스티나 아프 요흐닉 재단(Jonas & Christina af Jochnick Foundation), 스웨덴 당뇨병 협회(Swedish Association for Diabetology) 및 ERC-2018-AdG 834860-EYELETS의 지원을 받았습니다. 그림 도면은 FL-B가 BioRender.com 를 사용하여 만들었습니다.
27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
Absorbent pad | Attends | 203903 | |
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
FBS | Gibco | N/A | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
Isoflurane | Baxter | N/A | |
Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
Oculentum simplex | APL | N/A | |
PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
Viscotears | Novartis | N/A | |
William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |