マウス眼の前房に移植された肝スフェロイドのin vivoイメージング

動物に対して行われたすべての手順は、カロリンスカ研究所の動物実験倫理委員会によって承認されました。 1. in vitroでのマウス初代肝細胞の抽出と肝スフェロイドの作製 準備カニューレ挿入、肝臓切除、および初代肝細胞の単離のために、血清学的ピペットおよび遠心分離チューブ(図1A)に加えて、以下の滅菌または単回使用の材料を準備します:蠕動ポンプ、スイングバケット遠心分離機、吸収パッド、解剖マット、2つの湾曲した先端鉗子、手術用ハサミ、1つの27Gバタフライニードル、1つの70μmセルストレーナー、1つのセルリフター、1つの100mmペトリ皿、 細胞計数室、96ウェルのU字型底マイクロプレート。 表1に示すように、肝灌流、初代肝細胞の単離、および肝スフェロイドの生成に使用する溶液を調製します。注:消化バッファーとグラジエント溶液は新鮮に調製する必要があります。 42°Cの水浴から肝臓に溶液を導く蠕動ポンプからなる灌流システムをセットアップします(図1A)。水浴の温度が高いほど、バッファーは最適な温度である37°Cで肝臓に到達します。 チューブの長さと室温(RT)に応じてカスタマイズします。 カニューレ挿入には、27Gのバタフライニードルをチューブの端に取り付けます。最終絶縁工程で使用するめっき媒体は4°Cに保ちます。 プロシージャ42°Cの水浴中で、50 mLの遠心チューブに、40 mLのPBS、20 mLの灌流バッファー、および12 mLの消化バッファー溶液を予熱します。 ポンプチューブを洗浄して温めるには、予熱したPBSを約20mL循環させます。 チューブを灌流バッファーに交換し、チューブとバタフライニードルをプライミングし、流速を4 mL/minに設定します。プロトコル全体を通して、バッファー交換中にチューブ内に気泡が入らないようにしてください。 子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させ、針を使用して手足を解剖板に固定します。 腹部の毛皮を70%エタノールで濡らし、消化器官にアクセスするために解剖します。 腸を右に動かして、門脈と下大静脈を露出させます(図1B)。 針を水平にして大静脈を長さの約半分にカニューレし、安定していることを確認してから、ポンプを始動します。 肝臓が膨らみ始めたら、または近くの葉に白い点が現れたら、門脈を切って血液と灌流バッファーを排出させます。 肝臓はすぐにブランチングを開始するはずです。湾曲した鉗子を使用して、門脈を5秒間隔でクランプするクリアを奨励します。 肝臓が黄色くなり、血液がなくなるまで手順1.2.9を繰り返します(約15〜20 mLの灌流バッファー)。 チューブを消化バッファーに交換するために蠕動ポンプを停止し、ポンプを再起動します。消化バッファーが肝臓に到達したら、流速を2.5 mL/minに下げます。注:消化バッファー中のフェノールレッドは、肝臓への到着を識別し、治療中のポンプパラメータの調整を可能にします。 バッファーがすべての肝葉に到達し、適切な消化を確実にするために、手順1.2.9を数回繰り返します。 消化バッファーが枯渇した場合、または肝臓が十分に消化されたように見える場合は、蠕動ポンプの流れを停止します。注:消化の程度は、鉗子で肝葉をそっとつまみ、組織に小さな跡が現れるかどうかを確認することで視覚的に監視できます。肝臓も薄っぺらになります。 肝臓を摘出するには、腹腔内の肝靭帯と接続部を切断し、完全に除去することを目指し、10mLの冷めっき培地を入れたペトリ皿に入れます(表1)。 胆嚢を取り除いた後、鉗子を使用して葉に小さなつまみを作り、肝嚢を軽く引き裂きます。皿の中で肝臓を振って、細胞が培地に注がれるのを観察します。 鉗子で肝臓を安定させ、細胞リフターを葉に沿ってそっと引きずり、細胞を解放します。注:正しい小葉間消化は、組織片ではなく、培地中の細胞懸濁液につながります。 血清学的ピペットを使用して、ペトリ皿から細胞懸濁液を回収し、50mLの遠心分離チューブに置いた70μmの細胞ストレーナーでろ過します。新鮮なめっき培地を使用して、消化された肝細胞の皿を洗い、フィルターに移します。 50 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。 上清を取り除き、細胞ペレットを覆うために約1 mLを残し、チューブを旋回させて細胞を再懸濁し、10 mLの冷めっき培地を徐々に加えます。 10 mLのグラジエント溶液を細胞懸濁液に加え、チューブを10回静かに反転させます。 200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 ペレットには肝細胞が豊富な生存可能な肝細胞が含まれ、上清には死んだ細胞と破片が含まれています。血清学的ピペットを使用して上清を捨て、約1 mLを残し、穏やかに旋回してペレットを再懸濁します。 20 mLのコールドプレーティング培地を細胞懸濁液に加え、50 x g で4°Cで5分間遠心分離して、グラジエント溶液を洗い流します。 ペレットの上に約1 mLを残して上清を取り除き、細胞を20 mLの冷間めっき培地に再懸濁します。注:ここでは、細胞ペレットを圧縮できるため、必要に応じて、10mLの血清ピペットを使用して細胞を穏やかに解離します。 細胞数と生存率を、細胞計数チャンバーとトリパンブルーを用いて手動で測定します。注:肝細胞はチューブ内で急速に沈殿します。それらを再懸濁するには、チューブを数回静かに反転させます。 1200細胞/ウェルのめっき培地200μL/ウェル中の肝細胞を96ウェルの超低接着プレートに播種します。注:ウェルあたりの最適な培地容量は200μLです。ただし、100μL /ウェルで細胞を播種することは可能です。 プレートを200 x g で3分間回転させて、ウェルの中央に細胞を集めます。 細胞をインキュベート(37°C、5%CO2)し、スフェロイドを形成するために5日間自然に置いておきます(図1C)。 5日目に、ウェル内の培地の半分を慎重に除去し、無血清のメンテナンス培地と交換します(表1)。肝スフェロイドを移植する準備が整う10日目まで、48時間ごとにこの手順を繰り返します。注:培養肝スフェロイドにおけるカプセル様構造の形成は、良好な凝集および生存率を示す。 2. 眼の前房への肝スフェロイド移植(ACE) 準備ACEへの肝スフェロイドの移植については、実体顕微鏡、イソフルラン麻酔ユニット、誘導室、イソフルラン、加熱パッド、カスタムメイドの金属ベースプレート、マウスヘッドホルダーとガスマスク、固体ユニバーサルジョイントに取り付けられた鉗子、ハミルトン500μLネジ付きプランジャーシリンジ、シリコーン、ポリエチレン、ポンプチューブ、カスタムメイドの鈍いガラスカニューレまたは24Gカテーテル、 エタノール70%、滅菌生理食塩水、滅菌23 G針、眼軟膏(流動パラフィンとワセリンの比率1:1)、使い捨て1 mLシリンジ、および細胞懸濁皿35 mm。 ハミルトンのシリンジ、チューブ、カニューレを70%エタノールと生理食塩水を通して洗浄します。 ハミルトンシリンジ、チューブ、ガラスカニューレに生理食塩水を入れ、ハミルトンシリンジをテープでベンチの水平位置に固定します(図2A)。 カスタムメイドの鈍いガラスカニューレを使用してください。2段式マイクロピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーを内径>300μmに伸ばし、スフェロイドを吸引できるようにします。 微小電極ベベラーを使用して先端を面取りして鈍くし、カニューレの先端を数秒間炎にさらしてエッジを柔らかくします。注:微小電極ベベラーは、手動で操作される回転サンディングストーンで構成されています。したがって、特定の設定は適用されません。 または、24 Gカテーテルのプラスチック部分を使用してカニューレを構築します(図2B)。 麻酔イソフルランユニットを準備し、加熱パッドを37°Cに温めます。 固体のユニバーサルジョイントに取り付けられた鉗子の先端をポリエチレンチューブで覆ってループを形成し、目を安定させるのに役立ちます。 ピペットと200 μLチップを使用して、肝臓スフェロイドを96ウェルプレートからメンテナンス培地を入れた35 mm細胞懸濁皿に移します。 プロシージャ2.5%イソフルランと280mL / minの空気の用量を使用して、誘導チャンバーでマウスを麻酔します。 マウスが意識を失ったら、麻酔を1.8%イソフルランと280mL / minの空気に下げ、麻酔チューブをヘッドホルダーに接続し、動物を加熱パッドにすばやく移し、鼻をヘッドホルダーの内側に配置します。 頭をネジで固定し、眼球をソケットからそっと飛び出して鉗子で固定し、乾燥を防ぐために両目に生理食塩水を滴下します。 ステレオスコープの下で、ハミルトンシリンジを使用して肝臓スフェロイドを吸引してカニューレの先端に集め、きれいな表面に水平に置きます。注:肝臓スフェロイドと一緒に培地を吸引すると、カニューレ壁に付着するのを防ぐのに役立ちます。 23Gの針を使用して角膜に注意深く穴を開け、浸透した房水を組織で乾かします。必要に応じて、切開部を広くするために、針を慎重に横にスライドさせて角膜をスライスします。注:角膜穿刺には使い捨ての滅菌針が使用されるため、切開前に角膜を消毒することはありません。 乾燥を避けるために生理食塩水を目に加えます。 肝臓のスフェロイドが入ったカニューレを取り、垂直に保持して、スフェロイドがカニューレの先端に引き寄せられるようにします。 カニューレを穴にそっと挿入し、ベベルを瞳孔に向けて、ハミルトンシリンジを使用して肝臓スフェロイドをACEにゆっくりと排出します(図2C)。注意: カニューレを取り外す前に、目の内外の液体圧力が再調整され、スフェロイドが目から逃げ出さないように数秒待つことをお勧めします。 角膜の外側から、カニューレの先端で角膜をそっと突いて、肝スフェロイドを瞳孔の周りに置き、切開部から遠ざけます(図2C)。 肝臓のスフェロイドが虹彩に落ち着くまで5~10分待ってから、鉗子から眼球を解放します。 ワセリン眼軟膏を手術眼に塗布し、角膜を滑らかにし、治癒させるのを助けます。 必要に応じて、同じ方法に従って2番目の目の手術に進みます。 マウスを目覚めさせる前に、術後の不快感を避けるために鎮痛剤を投与します(たとえば、滅菌生理食塩水中の0.1 mg / kgブプレノルフィンを皮下投与します。.注:マウスはこの小さな手順からすぐに回復し、痛みや行動の変化の兆候を示さなかったため、鎮痛薬は1回だけ投与されました。この手順は非常に迅速(10分未満)で、わずかな不快感しか引き起こさないため、マウスは動物を目覚めさせる前に投与される術後鎮痛以外の術後のケアを必要としません。 3. ACEにおける生着肝スフェロイドの in vivo イメージング 準備ACEに生着した肝スフェロイドの非侵襲的 in vivo イメージングのために、次の材料と器具を準備します(図3A):正立共焦点顕微鏡、長作動距離水浸対物レンズ、イソフルラン麻酔ユニット、誘導チャンバー、イソフルラン、加熱パッド、カスタムメイドの金属ベースプレート、マウスヘッドホルダーとガスマスク、固体ユニバーサルジョイントに取り付けられた鉗子、人工涙液ジェル、眼軟膏(流動パラフィンとワセリンの比率は1:1)。 オプションの材料には、注射可能な蛍光プローブ、使い捨て注射器、尾部静脈注射用の27G針が含まれます。 プロシージャ2.5%イソフルランと280mL / minの空気の用量を使用して、誘導チャンバーでマウスを麻酔します。 マウスが意識を失ったら、麻酔を1.8%イソフルランと280mL / minの空気に下げ、麻酔チューブをヘッドホルダーに接続し、動物を加熱パッドにすばやく移し、鼻をヘッドホルダーの内側に配置します。 ネジを使用して、ヘッドホルダーにヘッドを固定します。 乾燥を防ぐために、両目に人工涙液ジェルを一滴垂らします。 この時点で、尾静脈から蛍光プローブを静脈内注入し、直後に画像化します。 頭を傾け、眼窩から目をそっと外し、鉗子で対物レンズの下の位置に固定します。 角膜と対物レンズの間のスペースを埋めるために人工涙液ジェルをたっぷりと塗布し、接眼レンズを通して肝臓スフェロイドに焦点を合わせます。注:可能であれば、接眼レンズの1つの接眼レンズを取り外して、拡大されていない視力を獲得し、虹彩上のスフェロイドをより簡単に見つけます。 動物の呼吸の動きにもかかわらず高解像度のイメージングを取得するには、25倍の対物レンズと次のイメージング設定を使用します:フォーマット512 x 512ピクセル、スキャン速度600 Hz、Zスタックの厚さ3 μm。詳細な画像設定については 、表2を参照してください。注:イメージング全体を通して、麻酔濃度は1.6〜2.2 mL / hのイソフルランに調整され、浅く制御された呼吸リズムを達成し、それによって動物の動きを最小限に抑えます。 イメージングセッションの最後に、イソフルランを除去して動物を目覚めさせる前に、画像化された目をワセリン眼軟膏で治療します。