In Vivo הדמיה של כדורי כבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר

כל ההליכים שבוצעו בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים במכון קרולינסקה. 1. מיצוי תאי כבד ראשוניים של עכבר ויצירת ספרואידים במבחנה הכנהעבור קנולציה, כריתת כבד ובידוד של תאי כבד ראשוניים, הכינו את החומרים הסטריליים או החד-פעמיים הבאים בנוסף לפיפטות סרולוגיות ולצינורות צנטריפוגות (איור 1A): משאבה פריסטלטית, צנטריפוגת דלי נדנדה, פד סופג, מזרן דיסקציה, שני מלקחיים בעלי קצה מעוקל, מספריים כירורגיים, מחט פרפר אחת 27 גרם, מסננת תאים אחת בגודל 70 מיקרומטר, מרים תאים אחד, צלחת פטרי אחת בקוטר 100 מ”מ, תא ספירת תאים, ומיקרו-צלחות תחתונות בצורת U 96-Well. הכינו את התמיסות המשמשות לזילוח הכבד, בידוד תאי כבד ראשוניים ויצירת ספרואידים בכבד כמפורט בטבלה 1.הערה: יש להכין את מאגר העיכול ואת תמיסת שיפוע השיפוע טריים. הגדירו את מערכת הזילוח המורכבת ממשאבה פריסטלטית, אשר מוליכה תמיסות מאמבט המים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס אל הכבד (איור 1A). הטמפרטורה הגבוהה יותר של אמבט המים מבטיחה כי חוצצים להגיע לכבד בטמפרטורה אופטימלית של 37 °C (77 °F). התאם אישית זאת בהתאם לאורך הצינור ולטמפרטורת החדר (RT). עבור הקנולציה, להתאים מחט פרפר 27 G לקצה הצינור. שמור על מדיית הציפוי המשמשת בשלבי הבידוד הסופיים ב- 4 ° C. פרוצדורהחממו מראש את התמיסות הבאות באמבט המים של 42 מעלות צלזיוס בצינורות צנטריפוגות של 50 מ”ל: 40 מ”ל של PBS, 20 מ”ל של חיץ זילוח ו -12 מ”ל של חיץ עיכול. כדי לנקות ולחמם את צינורות המשאבה, הזרים כ -20 מ”ל של PBS שחומם מראש. החליפו את הצינור למאגר הזילוח, הגדילו את הצינור ומחט הפרפר והגדירו את קצב הזרימה ל-4 מ”ל/דקה. ודא שאין בועות בצנרת במהלך שינויי חיץ לאורך כל הפרוטוקול. הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם והשתמשו במחטים כדי לקבע את הגפיים ללוח הניתוח. הרטיבו את פרוות הבטן עם 70% אתנול ונתחו אותה כדי לגשת לאברי העיכול. הזיזו את המעיים ימינה כדי לחשוף את הווריד הפורטלי ואת הווריד הנבוב התחתון (איור 1B). מקננים את הווריד קאווה בערך באמצע אורכו עם המחט במצב אופקי, מוודאים שהיא יציבה ומתחילים את המשאבה. כאשר הכבד מתחיל להתנפח, או נקודות לבנות מופיעות באונות הקרובות יותר, חתכו את וריד השער כדי לאפשר למאגר הדם והזילוח להתנקז החוצה. הכבד צריך להתחיל להלבין מיד. עודדו ניקוי באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי להדק את וריד הפורטל במרווחים של 5 שניות. חזור על שלב 1.2.9 עד שהכבד צהוב ונקי מדם (כ 15-20 מ”ל של חיץ זילוח). עצור את המשאבה הפריסטלטית כדי להחליף את הצינורית למאגר העיכול והפעל מחדש את המשאבה. כאשר מאגר העיכול מגיע לכבד, הפחיתו את קצב הזרימה ל-2.5 מ”ל/דקה.הערה: הפנול האדום בחיץ העיכול מאפשר להבחין בהגעתו לכבד ומאפשר התאמה של פרמטרים של המשאבה במהלך הטיפול. כדי לעודד את החיץ להגיע לכל אונות הכבד ולהבטיח עיכול תקין, חזור על שלב 1.2.9 מספר פעמים. עצור את זרימת המשאבה הפריסטלטית כאשר מאגר העיכול מתרוקן או שהכבד נראה מתעכל מספיק.הערה: ניתן לנטר חזותית את מידת העיכול על ידי צביטה עדינה של אונות הכבד במלקחיים ובדיקה אם מופיעים סימנים קטנים על הרקמה. גם הכבד יהיה דקיק. כדי לחלץ את הכבד, חתכו את רצועות הכבד ואת החיבורים בתוך חלל הבטן, במטרה להסיר אותו לחלוטין, והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה 10 מ”ל של מדיום ציפוי קר (טבלה 1). לאחר הסרת כיס המרה, לעשות צביטות קטנות על האונות באמצעות מלקחיים, קורע קלות את הקפסולה בכבד. על ידי ניעור הכבד בצלחת, התבוננו בתאים הנשפכים החוצה למדיום. החזיקו את הכבד יציב עם מלקחיים, גררו בעדינות את מרים התאים לאורך האונות כדי לשחרר את התאים.הערה: עיכול בין-לובולרי נכון יוביל להשעיית תאים במדיה, ולא לשברי רקמות. באמצעות פיפטה סרולוגית, לאסוף את תרחיף התא מצלחת פטרי ולסנן דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר הממוקם על צינור צנטריפוגה 50 מ”ל. השתמש מדיה ציפוי טרי לשטוף את צלחת של תאי כבד מעוכל ולהעביר אותם לפילטר. צנטריפוגה ב 50 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי pellet את התאים. הסר את supernatant, משאיר כ 1 מ”ל כדי לכסות את גלולת התא, מערבלים את הצינור כדי להשעות מחדש את התאים, ולאחר מכן בהדרגה להוסיף 10 מ”ל של ציפוי קר בינוני. הוסף את 10 מ”ל של תמיסת שיפוע לתרחיף התא והפוך בעדינות את הצינור 10 פעמים. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. הגלולה מכילה תאי כבד ברי קיימא המועשרים בהפטוציטים, ואילו הסופרנאטנט מכיל תאים מתים ופסולת. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית, תוך השארת כ-1 מ”ל, ולהשהות מחדש את הגלולה על ידי ערבול עדין. הוסף 20 מ”ל של מדיום ציפוי קר למתלה התא ולצנטריפוגה ב- 50 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 ° C כדי לשטוף את תמיסת השיפוע. הסר את supernatant, משאיר כ 1 מ”ל מעל הכדור, ו resuspend את התאים ב 20 מ”ל של מדיום ציפוי קר.הערה: כאן, ניתן לדחוס את גלולת התא, כך שאם יש צורך, השתמש פיפטה סרולוגית 10 מ”ל כדי לנתק בעדינות את התאים. קבע ידנית את מספר התא ואת הכדאיות באמצעות תא ספירת תאים ו- Trypan Blue.הערה: תאי הפטוציטים ישקעו במהירות בצינור; כדי להשעות אותם מחדש, הפוך בעדינות את הצינור כמה פעמים. זרעו את תאי הכבד ב-200 מיקרוליטר/באר של ציפוי בינוני ב-1200 תאים/באר לתוך לוחות היצמדות אולטרה-נמוכים של 96 באר.הערה: נפח המדיה האופטימלי לכל באר הוא 200 μL; עם זאת, ניתן לזרוע תאים ב 100 μL / טוב. סובבו את הצלחות ב 200 x גרם במשך 3 דקות כדי לאסוף את התאים במרכז הבארות. דגרו (37°C, 5% CO2) על התאים והניחו להם ליצור ספרואידים במשך 5 ימים (איור 1C) באופן טבעי. ביום 5, הוציאו בזהירות מחצית מהמדיה שבבאר והחליפו אותה באמצעי תחזוקה ללא נסיוב (טבלה 1). חזור על שלב זה כל 48 שעות עד יום 10, כאשר כדורי הכבד מוכנים להשתלה.הערה: היווצרות מבנה דמוי קפסולה בכדורי כבד בתרבית מראה צבירה טובה וכדאיות. 2. השתלת ספרואידים בכבד לחדר הקדמי של העין (ACE) הכנהלהשתלת ספרואידים של כבד לתוך ACE, הקפד לארגן את המשאבים הבאים (איור 2A): סטריאומיקרוסקופ, יחידת הרדמה איזופלורן, תא אינדוקציה, איזופלורן, כרית חימום, פלטת בסיס מתכת בהתאמה אישית, מחזיק ראש עכבר ומסיכת גז, מלקחיים המחוברים למפרק האוניברסלי המוצק, מזרק בוכנה מושחל המילטון 500 מיקרוליטר, סיליקון, פוליאתילן וצינורות משאבה, צינורית זכוכית קהה בהתאמה אישית או קטטר 24 גרם, אתנול 70%, מי מלח סטריליים, מחטים סטריליות 23 גרם, משחת עיניים (פרפין נוזלי וזלין ביחס של 1:1), מזרק חד פעמי של 1 מ”ל ותרחיף תאים 35 מ”מ. נקו את מזרק המילטון, הצינורית והצינורית על ידי העברת 70% אתנול ומלוחים. מלאו את מזרק המילטון, הצינור וצינורית הזכוכית במי מלח וקיבעו את מזרק המילטון לספסל במצב אופקי בעזרת סרט הדבקה (איור 2A). השתמשו בצינורית זכוכית קהה בהתאמה אישית.האריכו נימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרופיפטה דו-שלבי לקוטר פנימי של >300 מיקרומטר כדי לאפשר את שאיפת הספרואידים. משופעים ומקהים את הקצה באמצעות משופע מיקרואלקטרודות וחושפים את קצה הצינורית ללהבה למשך מספר שניות כדי לרכך את הקצוות.הערה: שיפוע המיקרואלקטרודות מורכב מאבן שיוף מסתובבת המופעלת ידנית; לכן, הגדרות ספציפיות אינן ישימות. לחלופין, בנו צינורית באמצעות החלק הפלסטי של צנתר 24G (איור 2B). הכינו את יחידת איזופלורן ההרדמה וחממו את כרית החימום ל-37°C. מכסים את קצות המלקחיים המחוברים למפרק האוניברסלי המוצק עם חתיכת צינורות פוליאתילן כדי ליצור לולאה, המסייעת לייצב את העין. מעבירים את כדורי הכבד מהצלחת בעלת 96 הקידוחים לצלחת תרחיף תאים בקוטר 35 מ”מ עם אמצעי תחזוקה באמצעות פיפטה וקצה של 200 מיקרוליטר. פרוצדורהמרדימים את העכבר בתא האינדוקציה באמצעות מינון של 2.5% איזופלורן ואוויר של 280 מ”ל/דקה. כאשר העכבר מחוסר הכרה, הורידו את חומר ההרדמה ל-1.8% איזופלורן ו-280 מ”ל/דקה, חברו את צינור ההרדמה למחזיק הראש, והעבירו במהירות את בעל החיים לכרית החימום, תוך מיקום האף בתוך מחזיק הראש. לשתק את הראש עם הברגים, להוציא בעדינות את העין מהשקע ולאבטח אותה עם המלקחיים ולהניח טיפת מלח על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. תחת הסטריאוסקופ, השתמש מזרק המילטון כדי לשאוף ולאסוף את כדורי הכבד לתוך קצה הצינורית ולהשאיר אותם לנוח אופקית על משטח נקי.הערה: מדיה שואפת יחד עם כדורי הכבד מסייעת למנוע מהם להידבק לדפנות הצינורית. בזהירות לנקב את הקרנית באמצעות מחט 23 גרם ולייבש את הומור מימי מחלחל עם רקמה. במידת הצורך, כדי להרחיב את החתך, החליקו בזהירות את המחט הצידה כדי לחתוך את הקרנית.הערה: מחט סטרילית חד פעמית משמשת לביצוע ניקוב הקרנית, כך שהקרנית אינה מחוטאת לפני החתך. הוסיפו טיפות מלח לעין כדי למנוע ייבוש. קח את הצינורית המכילה את כדורי הכבד והחזק אותה במאונך כדי לאפשר לכדוריות להימשך לכיוון קצה הצינורית. הכניסו בעדינות את הצינורית לתוך החור, וכשהשיפוע מופנה לכיוון האישון, השתמשו במזרק המילטון כדי לגרש באיטיות את כדורי הכבד לתוך ACE (איור 2C).הערה: לפני הסרת הצינורית, מומלץ להמתין מספר שניות עד שהלחצים הנוזליים בתוך העין ומחוצה לה יתאמו מחדש וימנעו את בריחת הספרואידים חזרה אל מחוץ לעין. מחוץ לקרנית, מקמו את כדורי הכבד סביב האישון והרחיקו אותו מהחתך על-ידי דחיפת הקרנית בעדינות עם קצה הצינורית (איור 2C). המתן ~ 5-10 דקות עד שכדורי הכבד יתיישבו על הקשתית לפני שחרור העין מהמלקחיים. החל משחת עיניים וזלין על העין המנותחת, אשר מסייע לשמן ולרפא את הקרנית. אם תרצה, המשך לנתח את העין השנייה באותה שיטה. לפני התעוררות העכבר, לנהל משכך כאבים כדי למנוע אי נוחות לאחר הניתוח, למשל, 0.1 מ”ג / ק”ג buprenorphine במי מלח סטריליים, מנוהל תת עורית.הערה: רק מנה אחת של משככי כאבים ניתנה לעכברים מכיוון שהם התאוששו במהירות מהליך קטן זה ולא הראו סימני כאב או שינוי בהתנהגות. מכיוון שהליך זה מהיר מאוד (לוקח פחות מ -10 דקות) וגורם לאי נוחות קלה בלבד, העכברים אינם זקוקים לטיפול לאחר הניתוח, מלבד שיכוך כאבים לאחר הניתוח המנוהל לפני התעוררות החיה. 3. הדמיית In vivo של ספרואידים מושתלים בכבד ב- ACE הכנההכינו את החומרים והמכשירים הבאים להדמיית in vivo לא פולשנית של ספרואידים בכבד שהושתלו ב-ACE (איור 3A): מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף, יעד טבילת מים למרחקי עבודה ארוכים, יחידת הרדמה איזופלורנית, תא אינדוקציה, איזופלורן, כרית חימום, פלטת בסיס מתכתית בהתאמה אישית, מחזיק ראש עכבר ומסיכת גז, מלקחיים המחוברים למפרק האוניברסלי המוצק, ג’ל דמעות מלאכותי, משחת עיניים (פרפין נוזלי וזלין ביחס של 1:1). חומרים אופציונליים כוללים בדיקות פלואורסצנטיות בהזרקה, מזרקים חד פעמיים ומחטי 27 G להזרקה תוך ורידית של הזנב. פרוצדורהמרדימים את העכבר בתא האינדוקציה באמצעות מינון של 2.5% איזופלורן ואוויר של 280 מ”ל/דקה. כאשר העכבר מחוסר הכרה, הורידו את חומר ההרדמה ל-1.8% איזופלורן ו-280 מ”ל/דקה, חברו את צינור ההרדמה למחזיק הראש, והעבירו במהירות את בעל החיים לכרית החימום, תוך מיקום האף בתוך מחזיק הראש. לשתק את הראש במחזיק הראש באמצעות הברגים. יש למרוח טיפה של ג’ל דמעות מלאכותי על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. בשלב זה, להזריק תוך ורידי בדיקות פלואורסצנטיות דרך וריד הזנב תמונה מיד לאחר מכן. הטו את הראש, הוציאו בעדינות את העין מהשקע, ואבטחו אותה במלקחיים למקומה מתחת למטרה. מרחו כמות נדיבה של ג’ל דמעות מלאכותי כדי למלא את החלל שבין הקרנית למטרה והתמקדו בכדורי הכבד דרך העינית.הערה: במידת האפשר, הסר את העינית של אחד האוקולרים כדי להשיג ראייה שאינה מוגדלת ולאתר בקלות רבה יותר את הספרואידים על הקשתית. על מנת לקבל הדמיה ברזולוציה גבוהה למרות תנועות הנשימה של החיה, השתמש במטרות 25x ובהגדרות ההדמיה הבאות: פורמט 512 x 512 פיקסלים, מהירות סריקה של 600 הרץ ועובי ערימת Z של 3 מיקרומטר. ראו הגדרות הדמיה מפורטות בטבלה 2.הערה: במהלך ההדמיה, ריכוז ההרדמה מותאם מ 1.6-2.2 מ”ל / שעה isoflurane כדי להשיג קצב נשימה רדוד ומבוקר ובכך למזער את התנועה של החיה. בסיום ההדמיה, יש לטפל בעיניים המצולמות באמצעות משחת עיניים וזלין לפני הסרת איזופלורן והתעוררות החיה.