Nous décrivons ici une plateforme qui permet une imagerie in vivo non invasive de sphéroïdes hépatiques greffés dans la chambre antérieure de l’œil de souris. Le flux de travail s’étend de la génération de sphéroïdes à partir de cellules hépatiques primaires à la transplantation dans l’œil de la souris et à l’imagerie in vivo à résolution cellulaire par microscopie confocale.
Les études biomédicales du foie chez les mammifères sont entravées par le manque de méthodes d’imagerie longitudinale non invasive in vivo à résolution cellulaire. Jusqu’à présent, l’imagerie optique du foie in situ était possible par l’imagerie intravitale, qui offre une imagerie à haute résolution au niveau cellulaire mais ne peut pas être réalisée plusieurs fois et, donc, longitudinalement chez le même animal. Les méthodes d’imagerie non invasives, telles que la bioluminescence, permettent des séances d’imagerie répétées sur le même animal mais n’atteignent pas la résolution cellulaire. Pour combler cette lacune méthodologique, nous avons développé une plateforme d’imagerie in vivo non invasive de sphéroïdes hépatiques greffés dans la chambre antérieure de l’œil de souris. Dans le flux de travail décrit dans cette étude, des sphéroïdes primaires du foie de souris sont générés in vitro et transplantés dans la chambre antérieure de l’œil des souris receveuses, où ils se greffent sur l’iris. La cornée agit comme une fenêtre corporelle naturelle à travers laquelle nous pouvons imager les sphéroïdes greffés par la microscopie confocale conventionnelle. Les sphéroïdes survivent pendant des mois dans l’œil, au cours desquels les cellules peuvent être étudiées dans des contextes de santé et de maladie, ainsi que d’être surveillées en réponse à différents stimuli au cours de séances d’imagerie répétées à l’aide de sondes fluorescentes appropriées. Dans ce protocole, nous détaillons les étapes nécessaires à la mise en œuvre de ce système d’imagerie et expliquons comment exploiter au mieux son potentiel.
La surveillance de la fonction hépatique chez les mammifères pendant la santé et la maladie est limitée par le manque de techniques d’imagerie in vivo non invasives à haute résolution. La visualisation de cet organe est entravée par son emplacement inaccessible, et afin de reconstituer les processus cellulaires, les études in vivo reposent sur le sacrifice d’animaux à différents moments temporels. Pour contourner cette limitation de l’imagerie, une grande partie des travaux s’appuie sur des modèles in vitro , dans lesquels des microtissus semblables à ceux du foie sont visualisés et étudiés dans un environnement contrôlé.
Au cours des dernières années, le développement de systèmes de culture tridimensionnels, tels que les sphéroïdes hépatiques, a contribué et fait progresser la recherche sur le foie. Les sphéroïdes hépatiques sont des agrégats multicellulaires qui imitent le microenvironnement et les interactions cellule-cellule complexes du tissu hépatique dans une certaine mesure1 et offrent des avantages évidents par rapport aux cultures monocouches traditionnelles 2,3. Les sphéroïdes hépatiques sont également utilisés comme modèles pour différentes maladies du foie 4,5,6 et ont joué un rôle déterminant dans la compréhension des mécanismes de la maladie. Pourtant, les principales limites des modèles hépatiques in vitro actuels sont l’absence d’un milieu physiologique in vivo et le temps d’utilisation limité en culture (environ 20 jours)3. Des sphéroïdes hépatiques ont déjà été transplantés à différents sites in vivo, comme sous la capsule rénale7 ou l’intrapéritonéale8, qui ne sont pas accessibles pour l’imagerie optique. L’imagerie intravitale du foie est une technique de pointe offrant une imagerie en temps réel à résolution cellulaire. Actuellement, cette imagerie hépatique in situ n’est possible que sur l’organe extériorisé, très invasif et souvent terminal9. Bien que la mise en place d’une fenêtre abdominale permette des séances répétées d’imagerie hépatique, elle implique une intervention chirurgicale et un suivi complexes.
Pour effectuer un suivi longitudinal à résolution cellulaire, nous avons exploré la transplantation de sphéroïdes hépatiques dans la chambre antérieure de l’œil (ECA) de souris, où le tissu hépatique est greffé dans un milieu physiologique, connecté aux stimuli corporels et accessible pour l’imagerie optique. La cornée est un tissu transparent et agit comme une fenêtre à travers laquelle les microtissus greffés sur l’iris peuvent être imagés de manière non invasive et longitudinale par microscopie confocale. Nous présentons ici un flux de travail de cette nouvelle plateforme développée pour l’imagerie in vivo des sphéroïdes hépatiques10. Ce protocole est un guide étape par étape pour sa mise en œuvre, divisé en (1) l’extraction de cellules hépatiques primaires de souris et la formation in vitro de sphéroïdes hépatiques, (2) la transplantation de sphéroïdes hépatiques dans l’ECA de souris receveuses, et (3) l’imagerie in vivo de sphéroïdes hépatiques greffés chez des souris anesthésiées. De plus, nous présenterons certaines des possibilités et des applications de cette plate-forme d’imagerie.
Ce protocole décrit une nouvelle plateforme pour l’imagerie intraoculaire in vivo de sphéroïdes hépatiques greffés dans l’ACE. L’ACE a déjà été utilisé comme site de transplantation d’autres microtissus dérivés d’organes, tels que les îlots pancréatiques11,12, en raison de son microenvironnement de greffe unique, riche en vaisseaux, en nerfs et en oxygène, et de l’accès à l’imagerie par la cornée. Alors que l’imagerie hépatique intravitale permet de visualiser les cellules et les processus in situ, la surveillance longitudinale n’est pas possible. L’imagerie hépatique à travers une fenêtre abdominale implique une intervention chirurgicale complexe, et le mouvement de l’organe dans le corps rend difficile le suivi d’une cellule unique au fil du temps. Par conséquent, cette nouvelle méthode d’imagerie permet une surveillance longitudinale non invasive des cellules hépatiques à une résolution unicellulaire.
Ce protocole est divisé en trois parties. La première est l’isolement des hépatocytes primaires par perfusion de collagénase en deux étapes, adaptée de Charni-Natan et al.13, à la différence que nous effectuons la perfusion hépatique sur la souris morte au lieu des animaux vivants anesthésiés. Cette variation apporte certains avantages, tels que moins de considérations éthiques et l’évitement des résidus d’anesthésie dans l’organisme. Dans ce travail, nous générons des sphéroïdes hépatiques à partir de la fraction enrichie en hépatocytes de l’isolement, mais cela n’exclut pas le potentiel d’isoler d’autres populations de cellules non parenchymateuses en utilisant d’autres protocoles spécialisés pour fabriquer des sphéroïdes de coculture de composition diverse14,15.
La deuxième partie de ce protocole implique la transplantation des sphéroïdes hépatiques dans l’ECA de souris receveuses. Il s’agit d’une chirurgie rapide (moins de 10 min) et simple réalisée chez des souris anesthésiées et ne nécessitant aucun traitement postopératoire. La ponction de la cornée s’auto-scelle et guérit en 3 à 5 jours. Parfois, au cours du processus de guérison, un peu de bizutage est observé autour de l’incision, mais cela disparaît en quelques jours. Nous n’avons pas connu de cas de synéchie antérieure dans les yeux d’animaux opérés. Nous effectuons les procédures de transplantation dans un laboratoire propre mais en plein air et sans problèmes d’infections des yeux opérés. L’inoculation et la greffe de sphéroïdes dans l’œil ne compromettent pas la vision ni n’altèrent le comportement de l’animal receveur. Dans ce protocole, nous utilisons l’anesthésie à l’isoflurane à la fois pour la chirurgie de transplantation et l’imagerie in vivo , qui est bien tolérée chez la souris. En raison de son effet dose-dépendant, il peut être facilement ajusté tout au long des procédures et présente l’avantage de réduire les temps de sommeil et de réveil. Cependant, d’autres anesthésiques injectables peuvent être utilisés. Après la transplantation, on laisse généralement 1 mois aux sphéroïdes pour se greffer complètement, se vasculariser et s’innerver, avant d’effectuer des interventions de traitement et d’imagerie in vivo . Nous avons également montré que la transplantation et la greffe sont possibles en utilisant des sphéroïdes hépatiques humains et des souris receveuses immunodéprimées10.
La troisième partie de cette méthode est l’imagerie in vivo des sphéroïdes hépatiques greffés dans l’ACE. Ce protocole décrit l’installation d’imagerie in vivo, qui utilise des équipements de microscopie que l’on trouve couramment dans les installations d’imagerie de recherche. De plus, les matériaux spécialisés, tels que le support de tête de souris et la canule en plastique, sont maintenant disponibles dans le commerce. Avec cette configuration d’imagerie, nous sommes en mesure de capturer des sections z et d’obtenir une reconstruction tridimensionnelle de l’architecture du sphéroïde, en fonction de la profondeur de pénétration du laser et de la détection de fluorescence. La surveillance de la fonction cellulaire dans les sphéroïdes hépatiques greffés repose sur la visualisation de protéines fluorescentes qui rendent compte des types de cellules, des fonctions cellulaires et de la dynamique. Ainsi, cette plateforme d’imagerie peut être exploitée à l’aide de différentes modalités, seules ou en combinaison : (1) des sondes fluorescentes peuvent être administrées par voie intraveineuse, par exemple, des anticorps pour marquer et suivre les cellules ainsi que des colorants fonctionnels ; (2) Les sphéroïdes hépatiques peuvent être générés à partir de cellules isolées à partir de modèles de souris rapporteures qui expriment des protéines fluorescentes spécifiques du foie, par exemple, les sphéroïdes hépatiques FUCCI qui rendent compte de la dynamique du cycle cellulaire ; (3) La formation de sphéroïdes hépatiques in vitro peut être combinée à la transfection ou à la transduction, pour équiper les sphéroïdes de protéines fluorescentes et de biocapteurs. par exemple, les virus adéno-associés. Dans nos contextes expérimentaux et en utilisant un seul photon pour l’excitation, la profondeur d’imagerie qu’il est possible d’atteindre est d’environ 60-100 μm. Cependant, cela dépend de la puissance du laser et de la disponibilité de l’imagerie multiphotonique, des caractéristiques d’émission de la sonde de fluorescence et de la sensibilité des détecteurs, ainsi que de l’angle de l’œil dans lequel le sphéroïde est greffé. Après l’acquisition de l’imagerie, l’analyse d’image en aval peut être effectuée à l’aide de programmes populaires tels que Image J et Imaris. Par exemple, dans le cas du rapporteur FUCCI, les cellules actives du cycle cellulaire en vert peuvent être comptées et comparées au nombre total de globules rouges pour évaluer l’activité du cycle cellulaire dans le sphéroïde greffé. De plus, la plateforme d’imagerie ACE permet d’appliquer des substances sur l’œil (sous forme de gouttes ophtalmiques) ou de les injecter directement dans l’ACE pour traiter le greffon et surveiller sa réaction. Post-mortem, les sphéroïdes transplantés peuvent facilement être récupérés par microdissection manuelle et peuvent fournir des informations précieuses par des techniques ex vivo, telles que la coloration par immunofluorescence, l’analyse transcriptomique, etc.10.
Cette technique présente certaines limites. La première est que, d’après notre expérience, les souris receveuses doivent être albinos, c’est-à-dire avoir un iris non pigmenté. Lors de la greffe, les sphéroïdes du foie sont recouverts d’une monocouche de cellules de l’iris, ce qui n’affecte pas la viabilité ou la fonction des sphéroïdes, mais le pigment des cellules de l’iris empêche l’imagerie. Une deuxième considération est la stabilité lors de l’imagerie intraoculaire chez les souris anesthésiées. Lors des séances d’imagerie in vivo , la concentration anesthésique et la respiration de l’animal doivent être surveillées de près afin de minimiser les mouvements. Néanmoins, en utilisant les paramètres d’imagerie indiqués ici, nous sommes en mesure d’obtenir une imagerie à haute résolution au niveau de la cellule unique.
Pour résumer, ce protocole décrit la mise en œuvre d’une plateforme d’imagerie in vivo non invasive de tissus hépatiques greffés dans les yeux de souris. Nous utilisons des procédures simples, un équipement commun et des matériaux abordables, ce qui en fait une approche réalisable pour de nombreux enquêteurs. Ce modèle combine les avantages des sphéroïdes hépatiques 3D in vitro avec le milieu in vivo et l’accessibilité optique fournis par l’ACE pour créer une plate-forme précieuse pour l’étude de la physiologie et de la pathologie hépatiques dans la recherche fondamentale et les contextes précliniques.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l’Association suédoise du diabète, les fonds du Karolinska Institutet, le Conseil suédois de la recherche, la Fondation Novo Nordisk, la Fondation de la famille Erling-Persson, le programme de recherche stratégique sur le diabète du Karolinska Institutet, la Fondation de la famille Knut et Alice Wallenberg, la Fondation Jonas et Christina af Jochnick, l’Association suédoise de diabétologie et ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. Les dessins de figures ont été créés par FL-B à l’aide de BioRender.com.
27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
Absorbent pad | Attends | 203903 | |
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
FBS | Gibco | N/A | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
Isoflurane | Baxter | N/A | |
Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
Oculentum simplex | APL | N/A | |
PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
Viscotears | Novartis | N/A | |
William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |