在这里,我们描述了一个平台,该平台允许对植入小鼠眼前房的肝球体进行非侵入 性体内 成像。工作流程涵盖从原代肝细胞生成球状体到移植到小鼠眼中,以及通过共聚焦显微镜以细胞分辨率进行 体内 成像。
哺乳动物肝脏的生物医学研究受到缺乏细胞分辨率的 体内 无创纵向成像方法的阻碍。到目前为止,肝脏的 原位 光学成像可以通过活体成像实现,该成像在细胞水平上提供高分辨率成像,但不能多次进行,因此不能在同一只动物中纵向进行。非侵入性成像方法,如生物发光,允许对同一只动物进行重复成像,但不能达到细胞分辨率。为了解决这一方法学上的差距,我们开发了一个平台,用于对移植到小鼠眼前房的肝球体进行无创 体内 成像。在这项研究中描述的工作流程中,原代小鼠肝球体 在体外 产生并移植到受体小鼠的眼睛前房,在那里它们植入虹膜上。角膜充当一个自然的身体窗口,通过它,我们可以通过传统的共聚焦显微镜对移植的球体进行成像。球状体在眼睛中存活数月,在此期间,可以在健康和疾病的背景下研究细胞,并使用适当的荧光探针在重复成像过程中监测对不同刺激的反应。在该协议中,我们提供了实施该成像系统所需步骤的细分,并解释了如何最好地利用其潜力。
由于缺乏高分辨率、无创 的体内 成像技术,哺乳动物在健康和疾病期间的肝功能监测受到限制。该器官的可视化因其难以接近的位置而受到阻碍,并且为了将细胞过程拼凑在一起, 体内 研究依赖于动物在不同时间点的牺牲。为了规避这种成像限制,许多工作依赖于 体外 模型,其中肝脏样微组织在受控环境中可视化和研究。
近年来,肝球体等三维培养系统的发展帮助和推进了肝脏研究。肝球体是多细胞聚集体,在一定程度上模仿肝组织的微环境和复杂的细胞间相互作用1,与传统的单层培养物相比具有明显的优势 2,3。肝球体也被用作不同肝脏疾病的模型4,5,6,并且有助于理解疾病机制。尽管如此,目前体外肝脏模型的主要局限性是缺乏生理体内环境和有限的培养利用时间(约 20 天)3。肝球体先前已被移植到体内的不同部位,例如肾囊7 下或腹膜内8,这些部位无法进行光学成像。活体肝脏成像是一种最先进的技术,可提供细胞分辨率的实时成像。目前,这种原位肝脏成像只能在外部器官上进行,该器官具有高度侵入性,通常是终末9。虽然安装腹窗可以允许重复进行肝脏成像,但它需要复杂的手术和术后护理。
为了在细胞分辨率下进行纵向监测,我们探索了将肝球体移植到小鼠的眼睛前房 (ACE) 中,其中肝样组织被移植到生理环境中,连接到身体刺激,并可用于光学成像。角膜是一种透明组织,充当一个窗口,通过该窗口,植入虹膜上的微组织可以通过共聚焦显微镜进行非侵入性和纵向成像。在这里,我们介绍了这个新开发的肝球 体活体 成像平台的工作流程10。该协议是其实施的分步指南,分为(1)原代小鼠肝细胞的提取和肝球体的 体外 形成,(2)将肝球体移植到受体小鼠的ACE中,以及(3)麻醉小鼠中移植肝球体的 体内 成像。此外,我们将展示该成像平台的一些可能性和应用。
该协议描述了一种用于植入ACE的肝球体的眼内活体成像的新平台。ACE 以前曾被用作其他器官衍生微组织(如胰岛11,12)的移植部位,因为它具有独特的植入微环境,富含血管、神经和氧气,并且可以通过角膜进行成像。虽然活体肝脏成像可以原位观察细胞和过程,但无法进行纵向监测。通过腹窗进行肝脏成像需要复杂的手术,并且器官在体内的运动使得随着时间的推移进行单细胞追踪变得困难。因此,这种新颖的成像方法能够以单细胞分辨率对肝细胞进行无创的纵向监测。
该协议分为三个部分。首先是通过两步胶原酶灌注分离原代肝细胞,该法改编自 Charni-Natan 等人 13,不同之处在于我们对死小鼠而不是麻醉的活体动物进行肝脏灌注。这种变化带来了某些优点,例如较少的伦理考虑和避免生物体中的麻醉残留物。在这项工作中,我们从分离的肝细胞富集部分产生肝球状体,但这并不排除使用其他专门方案分离其他非实质细胞群以制作不同成分的共培养球状体的潜力14,15。
该协议的第二部分涉及将肝球体移植到受体小鼠的ACE中。这是一种在麻醉小鼠中进行的快速(不到 10 分钟)和简单的手术,不需要任何术后治疗。角膜穿刺自我封闭并在 3-5 天内愈合。偶尔,在愈合过程中,切口周围会观察到一些雾化,但这种情况会在几天内消失。我们还没有经历过手术动物眼前粘连的病例。我们在干净但露天的实验室中进行移植手术,手术眼部没有感染问题。球状体在眼睛中的接种和植入不会损害视力或改变受体动物的行为。在该方案中,我们使用异氟烷麻醉进行移植手术和 体内 成像,这在小鼠中具有良好的耐受性。由于其剂量依赖性效应,它可以在整个过程中轻松调整,并带来减少睡眠和觉醒时间的优势。但是,可以使用替代注射麻醉剂。移植后,我们通常允许 1 个月的时间让球状体完全植入、血管化和神经支配,然后再进行治疗干预和 体内 成像。我们还表明,使用人肝球体和免疫功能低下的受体小鼠10 进行移植和植入是可能的。
该方法的第三部分是 ACE 中移植肝球体的 体内 成像。该协议描述了 体内 成像设置,其使用研究成像设施中常见的显微镜设备。此外,专用材料,如鼠标头架和塑料套管,现在已经商业化了。通过这种成像设置,我们能够捕获 z 截面并获得球体结构的三维重建,具体取决于激光穿透和荧光检测的深度。监测移植肝球体中的细胞功能依赖于荧光蛋白的可视化,荧光蛋白报告细胞类型、细胞功能和动力学。因此,该成像平台可以单独或组合使用不同的模式进行利用:(1)荧光探针可以静脉内给药,例如,用于标记和追踪细胞的抗体以及功能性染料;(2)肝球体可以从表达肝脏特异性荧光蛋白的报告小鼠模型中分离的细胞中产生,例如,报告细胞周期动力学的FUCCI肝球体;(3)肝球体 外 的形成可以与转染或转导相结合,使球体配备荧光蛋白和生物传感器。例如,腺相关病毒。在我们的实验设置中,通过使用单个光子进行激发,可能达到的成像深度约为 60-100 μm。然而,这取决于激光功率和多光子成像的可用性、荧光探针发射特性和检测器的灵敏度,以及球状体移植的眼睛角度。成像采集后,可以使用 Image J 和 Imaris 等流行程序进行下游图像分析。例如,在FUCCI报告基因的情况下,可以对绿色的细胞周期活性细胞进行计数,并将其与总红细胞的数量进行比较,以评估移植球状体内的细胞周期活性。此外,ACE成像平台允许将物质施加到眼睛上(以滴眼液的形式)或直接注射到ACE中,以治疗移植物并监测其反应。尸检后,移植的球状体可以很容易地通过手动显微切割取回,并可以通过 离体 技术提供有价值的信息,如免疫荧光染色、转录组学分析等10。
这种技术有一定的局限性。首先,根据我们的经验,受体小鼠必须是白化病小鼠,即具有非色素沉着的虹膜。植入后,肝球体被单层虹膜细胞覆盖,这不会影响球体的活力或功能,但虹膜细胞中的色素会阻止成像。第二个考虑因素是麻醉小鼠眼内成像期间的稳定性。在 体内 成像过程中,必须密切监测动物的麻醉浓度和呼吸,以尽量减少运动。尽管如此,使用此处指示的成像设置,我们能够在单细胞水平上实现高分辨率成像。
总而言之,该协议描述了植入小鼠眼睛的肝样组织的非侵入 性体内 成像平台的实现。我们使用简单的程序、通用的设备和负担得起的材料,使其成为许多研究人员可以实现的方法。该模型将 体外 3D肝球体的优点与ACE提供的 体内 环境和光学可及性相结合,为在基础研究和临床前环境中研究肝脏生理学和病理学创造了一个有价值的平台。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了瑞典糖尿病协会,卡罗林斯卡学院基金,瑞典研究委员会,诺和诺德基金会,家庭Erling-Persson基金会,卡罗林斯卡医学院糖尿病战略研究计划,家庭Knut和Alice Wallenberg基金会,Jonas&Christina af Jochnick基金会,瑞典糖尿病学协会和ERC-2018-AdG 834860-EYELETS的支持。图形图纸由 FL-B 使用 BioRender.com 创建。
27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
Absorbent pad | Attends | 203903 | |
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
FBS | Gibco | N/A | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
Isoflurane | Baxter | N/A | |
Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
Oculentum simplex | APL | N/A | |
PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
Viscotears | Novartis | N/A | |
William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |