Generación y análisis posterior de transcriptomas de una sola célula y de un solo núcleo en organoides cerebrales

En los últimos años, las tecnologías de organoides se han convertido en una herramienta prometedora para el cultivo de tejidos similares a órganos ^1,2,3. Especialmente para los órganos a los que no se puede acceder fácilmente, como el cerebro humano, los organoides ofrecen la oportunidad de obtener información sobre el desarrollo y la manifestación de la enfermedad⁴. Como tal, los organoides cerebrales han sido ampliamente utilizados como modelo experimental para investigar diversos trastornos del cerebro humano, incluidas enfermedades del desarrollo, psiquiátricas o incluso neurodegenerativas ^4,5,6.

Con el advenimiento de las tecnologías de perfiles de transcriptoma de una sola célula, los tejidos humanos primarios y los modelos complejos in vitro pudieron estudiarse con un nivel de granularidad sin precedentes, proporcionando información mecanicista sobre los cambios en la expresión génica a nivel de las subpoblaciones celulares en la salud y la enfermedad e informando sobre nuevos objetivos terapéuticos putativos ^7,8,9. El campo de los organoides ha progresado mediante la utilización del perfil del transcriptoma de una sola célula para evaluar la composición celular, la reproducibilidad y la fidelidad de las tecnologías de organoides cerebrales 10,11,12. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) permitió la clasificación celular y la identificación de la desregulación genética en organoides enfermos^13,14. Es importante destacar que es la complejidad de los tejidos organoides lo que requiere la implementación de técnicas que permitan el perfil de células individuales. La caracterización de organoides utilizando métodos como el perfil del transcriptoma masivo (secuenciación masiva de ARN) conduce a una heterogeneidad celular enmascarada y perfiles de expresión génica que se promedian en todos los tipos de células dentro del tejido complejo, lo que en última instancia limita nuestra comprensión de los procesos en curso durante el desarrollo de organoides en la salud y la enfermedad 15,16,17. A medida que los métodos de scRNA-seq continúan avanzando, se está creando un número cada vez mayor de atlas, ejemplificados por recursos como el Allen Brain Atlas o el Single cell atlas of human brain organoids de Uzquiano et ^al.18.

El éxito de la scRNA-seq a partir de organoides cerebrales depende del aislamiento y la captura eficaces de las células intactas. Dado que la disociación de los organoides cerebrales para obtener células individuales se basa en la digestión enzimática, puede influir en los patrones de expresión génica al inducir estrés y daño celular^19,20. Por lo tanto, la disociación del tejido en células individuales es el paso más crucial. Un enfoque alternativo es la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq), que facilita la extracción sin enzimas de núcleos de tejidos, tanto frescos como congelados^21,22. Sin embargo, el aislamiento de núcleos de un tejido plantea otros desafíos, como el enriquecimiento de los tipos celulares de interés y el bajo contenido de ARN de los núcleos en comparación con las células.

Los estudios de transcriptoma de organoides cerebrales se realizan comúnmente utilizando scRNA-seq 10,18,23. Sin embargo, el aislamiento de núcleos individuales podría proporcionar un método ortogonal y complementario para investigar el perfil transcriptómico de los organoides. Aquí, presentamos una caja de herramientas para la secuenciación de scRNA y snRNA para organoides cerebrales y discutimos los puntos críticos para obtener datos de secuenciación de la mejor calidad.