Geração e análise a jusante de transcriptomas de célula única e núcleo único em organoides cerebrais

Nos últimos anos, as tecnologias organoides surgiram como uma ferramenta promissora para a cultura de tecidos semelhantes a órgãos ^1,2,3. Especialmente para órgãos que não podem ser facilmente acessados, como o cérebro humano, os organoides oferecem a oportunidade de obter insights sobre o desenvolvimento e a manifestação da doença⁴. Como tal, os organoides cerebrais têm sido amplamente utilizados como modelo experimental para investigar vários distúrbios cerebrais humanos, incluindo doenças do desenvolvimento, psiquiátricas ou mesmo neurodegenerativas ^4,5,6.

Com o advento das tecnologias de perfil de transcriptoma de célula única, tecidos humanos primários e modelos in vitro complexos podem ser estudados com um nível de granularidade sem precedentes, fornecendo insights mecanicistas sobre as mudanças na expressão gênica no nível de subpopulações celulares na saúde e na doença e informando sobre novos alvos terapêuticos putativos ^7,8,9. O campo organoide progrediu utilizando o perfil do transcriptoma de célula única para avaliar a composição celular, a reprodutibilidade e a fidelidade das tecnologias organoides cerebrais 10,11,12. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) permitiu a classificação celular e a identificação de desregulação genética em organoides doentes^13,14. É importante ressaltar que é a complexidade dos tecidos organoides que exige a implementação de técnicas que permitam o perfil de células individuais. A caracterização de organoides usando métodos como perfil de transcriptoma em massa (sequenciamento de RNA em massa) leva à heterogeneidade celular mascarada e perfis de expressão gênica que são calculados em média em todos os tipos de células dentro do tecido complexo, limitando nossa compreensão dos processos em andamento durante o desenvolvimento de organoides na saúde e na doença 15,16,17. À medida que os métodos scRNA-seq continuam avançando, um número crescente de atlas está sendo criado, exemplificado por recursos como o Allen Brain Atlas ou o Atlas de célula única de organoides cerebrais humanos de Uzquiano et ^al.18.

A realização bem-sucedida do scRNA-seq a partir de organoides cerebrais depende do isolamento efetivo e da captura de células intactas. Como a dissociação de organoides cerebrais para obter células individuais é baseada na digestão enzimática, ela pode influenciar os padrões de expressão gênica, induzindo estresse e dano celular^19,20. Portanto, a dissociação do tecido em células individuais é a etapa mais crucial. Uma abordagem alternativa é o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq), que facilita a extração livre de enzimas de núcleos de tecidos frescos e congelados^21,22. No entanto, o isolamento de núcleos de um tecido apresenta outros desafios, como o enriquecimento dos tipos celulares de interesse e o baixo conteúdo de RNA dos núcleos em comparação com as células.

Estudos de transcriptoma de organoides cerebrais são comumente conduzidos usando scRNA-seq 10,18,23. No entanto, o isolamento de núcleos únicos pode fornecer um método ortogonal e suplementar para investigar o perfil transcriptômico de organoides. Aqui, apresentamos uma caixa de ferramentas para scRNA- e snRNA-seq para organoides cerebrais e discutimos os pontos críticos para obter os dados de sequenciamento de melhor qualidade.