Generierung und Downstream-Analyse von Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomen in Hirnorganoiden

In den letzten Jahren haben sich Organoidtechnologien als vielversprechendes Werkzeug für die Kultivierung organähnlicher Gewebe erwiesen ^1,2,3. Gerade für Organe, die nicht leicht zugänglich sind, wie z.B. das menschliche Gehirn, bieten Organoide die Möglichkeit, Einblicke in die Entstehung und Krankheitsmanifestation zu gewinnen⁴. Daher wurden Gehirnorganoide häufig als experimentelles Modell zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen des menschlichen Gehirns verwendet, einschließlich Entwicklungs-, psychiatrischer oder sogar neurodegenerativer Erkrankungen ^4,5,6.

Mit dem Aufkommen von Einzelzell-Transkriptom-Profiling-Technologien konnten primäre menschliche Gewebe und komplexe In-vitro-Modelle mit einer noch nie dagewesenen Granularität untersucht werden, was mechanistische Einblicke in Genexpressionsänderungen auf der Ebene von Zellsubpopulationen bei Gesundheit und Krankheit lieferte und über neue mögliche therapeutische Ziele informierte ^7,8,9. Das Organoid-Feld hat sich weiterentwickelt, indem Einzelzell-Transkriptom-Profiling verwendet wurde, um die zelluläre Zusammensetzung, Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit von Organoid-Technologien im Gehirn zu beurteilen 10,11,12. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglichte die Zellklassifikation und die Identifizierung genetischer Dysregulation in erkrankten Organoiden^13,14. Wichtig ist, dass die Komplexität von organoiden Geweben die Implementierung von Techniken erfordert, die die Profilerstellung einzelner Zellen ermöglichen. Die Charakterisierung von Organoiden mit Methoden wie dem Bulk Transcriptome Profiling (Bulk RNA Sequencing) führt zu maskierten zellulären Heterogenitäts- und Genexpressionsprofilen, die über alle Zelltypen innerhalb des komplexen Gewebes gemittelt werden, was letztendlich unser Verständnis der ablaufenden Prozesse während der Organoidentwicklung in Gesundheit und Krankheit einschränkt 15,16,17 . Mit der Weiterentwicklung der scRNA-seq-Methoden wird eine zunehmende Anzahl von Atlanten erstellt, wie z. B. der Allen Brain Atlas oder der Single cell atlas of human brain organoids von Uzquiano et ^al.18.

Die erfolgreiche Durchführung von scRNA-seq aus Gehirnorganoiden hängt von der effektiven Isolierung und dem Einfangen intakter Zellen ab. Da die Dissoziation von Gehirnorganoiden zur Gewinnung einzelner Zellen auf enzymatischer Verdauung basiert, kann sie die Genexpressionsmuster beeinflussen, indem sie Stress und Zellschäden induziert^19,20. Daher ist die Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen der wichtigste Schritt. Ein alternativer Ansatz ist die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), die die enzymfreie Extraktion von Zellkernen sowohl aus frischem als auch aus gefrorenem Gewebe ermöglicht^21,22. Die Isolierung von Zellkernen aus einem Gewebe bringt jedoch weitere Herausforderungen mit sich, wie z. B. die Anreicherung von Zelltypen von Interesse und den geringen RNA-Gehalt von Zellkernen im Vergleich zu Zellen.

Transkriptomstudien an Gehirnorganoiden werden häufig mit scRNA-seq 10,18,23 durchgeführt. Die Isolierung einzelner Kerne könnte jedoch eine orthogonale und ergänzende Methode zur Untersuchung des transkriptomischen Profils von Organoiden darstellen. Hier stellen wir eine Toolbox für scRNA- und snRNA-seq für Hirnorganoide vor und diskutieren die kritischen Punkte, um die besten Sequenzierungsdaten zu erhalten.