脳オルガノイドにおけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトームの生成とダウンストリーム解析

ここ数年で、オルガノイド技術は臓器様組織を培養するための有望なツールとして浮上してきました^1,2,3。特に、人間の脳など、簡単にアクセスできない臓器の場合、オルガノイドは発生や疾患の発現に関する洞察を得る機会を提供します⁴。このように、脳オルガノイドは、発達疾患、精神疾患、さらには神経変性疾患など、さまざまなヒトの脳障害を調査するための実験モデルとして広く使用されてきました^4,5,6。

シングルセルトランスクリプトームプロファイリング技術の出現により、初代ヒト組織や複雑なin vitroモデルを前例のない粒度で研究できるようになり、健康や疾患における細胞亜集団レベルでの遺伝子発現変化に関するメカニズム的な洞察が得られ、新たな推定治療標的に関する情報を得ることができる^{ようになった7,8,9}.オルガノイド分野は、脳オルガノイド技術10,11,12の細胞組成、再現性、および忠実度を評価するために、シングルセルトランスクリプトームプロファイリングを利用することによって進歩してきた。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)により、疾患オルガノイドの細胞分類と遺伝的調節不全の同定が可能になりました^13,14。重要なことは、オルガノイド組織の複雑さが、個々の細胞のプロファイリングを可能にする技術の実装を必要とすることです。バルクトランスクリプトームプロファイリング(バルクRNAシーケンシング)などの方法を用いたオルガノイドの特性評価は、複雑な組織内のすべてのタイプの細胞で平均化されるマスクされた細胞の不均一性および遺伝子発現プロファイルをもたらし、最終的に健康および疾患におけるオルガノイド開発中の進行中のプロセスの理解を制限する15,16,17.scRNA-seq法が進歩し続けるにつれて、Allen Brain AtlasやUzquianoらによるヒト脳オルガノイドのシングルセルアトラスなどのリソースに代表されるように、ますます多くのアトラスが作成されています¹⁸。

脳オルガノイドからのscRNA-seqを成功させるには、無傷の細胞の効果的な単離と捕捉が必要です。個々の細胞を得るための脳オルガノイドの解離は酵素消化に基づいているため、ストレスや細胞損傷を誘発することにより遺伝子発現パターンに影響を与えることができる^19,20。したがって、組織を個々の細胞に解離させることが最も重要なステップです。別のアプローチは、単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)であり、これは新鮮組織と凍結組織の両方から核を酵素なしで抽出することを容易にする^21,22。しかし、組織からの核の単離には、目的の細胞の種類の濃縮や、細胞と比較して核のRNA含有量が低いなど、他の課題があります。

脳オルガノイドのトランスクリプトーム研究は、一般的にscRNA-seq 10,18,23を用いて行われます。しかし、単一核の単離は、オルガノイドのトランスクリプトームプロファイルを調査するための直交的かつ補足的な方法を提供する可能性があります。ここでは、脳オルガノイド用のscRNA-seqおよびsnRNA-seqのツールボックスを紹介し、最高品質のシーケンシングデータを取得するための重要なポイントについて説明します。