Generazione e analisi a valle di trascrittomi a singola cellula e a singolo nucleo in organoidi cerebrali

Negli ultimi anni, le tecnologie degli organoidi sono emerse come uno strumento promettente per la coltura di tessuti simili a organi ^1,2,3. Soprattutto per gli organi che non sono facilmente accessibili, come il cervello umano, gli organoidi offrono l’opportunità di ottenere informazioni sullo sviluppo e sulla manifestazione della malattia⁴. In quanto tali, gli organoidi cerebrali sono stati ampiamente utilizzati come modello sperimentale per studiare vari disturbi del cervello umano, tra cui malattie dello sviluppo, psichiatriche o persino neurodegenerative ^4,5,6.

Con l’avvento delle tecnologie di profilazione del trascrittoma a singola cellula, i tessuti umani primari e i modelli complessi in vitro potrebbero essere studiati con un livello di granularità senza precedenti, fornendo informazioni meccanicistiche sui cambiamenti dell’espressione genica a livello di sottopopolazioni cellulari in salute e malattia e fornendo informazioni su nuovi bersagli terapeutici putativi ^7,8,9. Il campo degli organoidi è progredito utilizzando il profilo del trascrittoma a singola cellula per valutare la composizione cellulare, la riproducibilità e la fedeltà delle tecnologie degli organoidi cerebrali 10,11,12. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha permesso la classificazione cellulare e l’identificazione della disregolazione genetica negli organoidi malati^13,14. È importante sottolineare che è la complessità dei tessuti organoidi che richiede l’implementazione di tecniche che consentano la profilazione delle singole cellule. La caratterizzazione degli organoidi utilizzando metodi come la profilazione del trascrittoma di massa (sequenziamento dell’RNA di massa) porta all’eterogeneità cellulare mascherata e ai profili di espressione genica che sono mediati in tutti i tipi di cellule all’interno del tessuto complesso, limitando in ultima analisi la nostra comprensione dei processi in corso durante lo sviluppo degli organoidi in salute e malattia 15,16,17. Man mano che i metodi scRNA-seq continuano ad avanzare, viene creato un numero crescente di atlanti, esemplificato da risorse come l’Allen Brain Atlas o l’atlante a cellula singola di organoidi cerebrali umani di Uzquiano et ^al.18.

Il successo dello scRNA-seq da organoidi cerebrali si basa su un efficace isolamento e cattura di cellule intatte. Poiché la dissociazione degli organoidi cerebrali per ottenere singole cellule si basa sulla digestione enzimatica, può influenzare i modelli di espressione genica inducendo stress e danno cellulare^19,20. Quindi, la dissociazione del tessuto in singole cellule è il passaggio più cruciale. Un approccio alternativo è il sequenziamento dell’RNA a nucleo singolo (snRNA-seq), che facilita l’estrazione senza enzimi di nuclei da tessuti freschi e congelati^21,22. Tuttavia, l’isolamento dei nuclei da un tessuto pone altre sfide come l’arricchimento dei tipi di cellule di interesse e il basso contenuto di RNA dei nuclei rispetto alle cellule.

Gli studi con trascrittoma degli organoidi cerebrali sono comunemente condotti utilizzando scRNA-seq 10,18,23. Tuttavia, l’isolamento di singoli nuclei potrebbe fornire un metodo ortogonale e supplementare per studiare il profilo trascrittomico degli organoidi. Qui, introduciamo una cassetta degli attrezzi per scRNA- e snRNA-seq per organoidi cerebrali e discutiamo i punti critici per ottenere dati di sequenziamento della migliore qualità.