Inmunoensayo portátil en papel combinado con una aplicación para teléfonos inteligentes para la detección colorimétrica y cuantitativa del antígeno NS1 del dengue
Summary
Para abordar las necesidades urgentes de diagnóstico del dengue, aquí presentamos un dispositivo analítico en papel basado en el dengue NS1 integrado en la aplicación para teléfonos inteligentes (DEN-NS1-PAD) para cuantificar la concentración del antígeno NS1 del dengue en muestras clínicas de suero/sangre. Esta innovación mejora el manejo del dengue al ayudar a la toma de decisiones clínicas en diversos entornos de atención médica, incluso en los de recursos limitados.
Abstract
La infección por el virus del dengue (DENV), que es transmitida por los mosquitos Aedes , es un importante problema de salud pública en los países tropicales y subtropicales. Con una incidencia anual de aproximadamente 10 millones de casos y entre 20.000 y 25.000 muertes, especialmente entre los niños, existe una necesidad urgente de herramientas prácticas de diagnóstico. La presencia de la proteína no estructural 1 (NS1) del dengue durante la infección temprana se ha relacionado con la liberación de citocinas, la fuga vascular y la disfunción endotelial, lo que la convierte en un marcador potencial de dengue grave.
Los inmunoensayos basados en papel, como los ensayos de flujo lateral (LFA) y los dispositivos analíticos microfluídicos basados en papel (PAD), han ganado popularidad como pruebas diagnósticas debido a su simplicidad, rapidez, bajo costo, especificidad y facilidad de interpretación. Sin embargo, los inmunoensayos convencionales en papel para la detección del dengue NS1 suelen basarse en la inspección visual, lo que solo arroja resultados cualitativos. Para abordar esta limitación y mejorar la sensibilidad, propusimos un ensayo de detección de dengue NS1 altamente portátil en un dispositivo analítico basado en papel (PAD), a saber, DEN-NS1-PAD, que integra una aplicación de teléfono inteligente como lector colorimétrico y cuantitativo. El sistema de desarrollo permite la cuantificación directa de las concentraciones de NS1 en muestras clínicas.
Se utilizaron muestras de suero y sangre obtenidas de los pacientes para demostrar el rendimiento del prototipo del sistema. Los resultados se obtuvieron de inmediato y pueden emplearse para la evaluación clínica, tanto en centros de salud bien equipados como en entornos de recursos limitados. Esta innovadora combinación de un inmunoensayo en papel con una aplicación para teléfonos inteligentes ofrece un enfoque prometedor para mejorar la detección y cuantificación del antígeno NS1 del dengue. Al aumentar la sensibilidad más allá de las capacidades del ojo humano, este sistema tiene un gran potencial para mejorar la toma de decisiones clínicas en el manejo del dengue, particularmente en áreas remotas o desatendidas.
Introduction
La infección por el virus del dengue (DENV) es la enfermedad transmitida por mosquitos que se propagamás rápidamente 1, y más de 390 millones de personas están infectadas con 96 millones de infecciones sintomáticas, 2 millones de casos de enfermedad grave y más de 25.000 muertes al año ocurren en el mundo 1,2. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que 3.900 millones de personas están en riesgo de contraer dengue; ~70% vive en países de Asia Pacífico y principalmente en el sudeste asiático3. En 2019, el número de casos de dengue notificados a la OMS fue de 4,2 millones, y Tailandia aportó al menos 136.000 casos de dengue y 144 casos de muerte por infección por dengue4. El brote de dengue en Tailandia se produce durante la temporada de lluvias, de abril a diciembre, tanto en zonas urbanas como rurales, especialmente en la zona nororiental.
Las infecciones por DENV tienen diferentes manifestaciones clínicas que van desde síntomas subclínicos, dengue leve (DF) hasta dengue hemorrágico grave (DH). La característica principal de la afección grave de DH es el aumento de la permeabilidad vascular seguido de shock y disfunción orgánica1. Comprender la vía molecular que puede causar la fuga vascular es muy importante para desarrollar tratamientos eficaces contra el dengue. La proteína no estructural 1 (NS1) del dengue es una glicoproteína secretada durante la infección temprana por virus 5,6 y funciona como un cofactor para la replicación del ARN viral7. NS1 puede desencadenar la liberación de citocinas y contribuir a la fuga vascular al unirse al receptor tipo toll 4 (TLR4) y al glicocálix endotelial 8,9. La investigación in vitro ha demostrado que NS1 interactúa con las células endoteliales e induce la apoptosis. Esta condición puede contribuir a la disfunción endotelial y a la fuga vascular10. Los niveles de antígeno NS1, correlacionados con los niveles séricos de interleucina (IL)-10, aumentaron significativamente en pacientes con enfermedad clínica grave11. El dengue NS1 también contribuye a la patogénesis de la enfermedad mediante la inducción de IL-10 y la supresión de las respuestas de las células T específicas del DENV12,13. Además, la proteína NS1 del dengue se relacionó con la enfermedad clínica grave, y la concentración de NS1 > 600 ng mL-1 en los primeros 3 días de la enfermedad se asoció con el desarrollo de DH14.
La persistencia del antígeno NS1 del dengue en pacientes con DH podría ser utilizada como marcador de dengue grave6. Existen varios métodos para detectar NS1 en muestras clínicas, como el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y la prueba rápida15. El estándar de oro para medir la concentración de proteínas NS1 en un entorno clínico es el método ELISA. Sin embargo, el método ELISA es costoso y requiere personal calificado e instalaciones de laboratorio16. Por lo tanto, el desarrollo de tecnología para detectar y cuantificar las proteínas NS1 en la prueba en el punto de atención (POCT) aún está en curso. En la última década, los inmunoensayos basados en papel, como los ensayos de flujo lateral (LFA) y los dispositivos analíticos microfluídicos basados en papel (μPAD), se han vuelto populares como pruebas diagnósticas debido a su simplicidad, rapidez, bajo costo y especificidad 17,18,19. En un inmunoensayo basado en papel, se han utilizado varias etiquetas para generar señales, como nanopartículas de oro (AuNPs)20, nanopartículas magnéticas21,22, puntos cuánticos23 y materiales de fluorescencia24,25. Las AuNP son las etiquetas más comunes utilizadas en los inmunoensayos en papel debido a su bajo costo de producción, facilidad de fabricación, estabilidad y lectura simple. En la actualidad, los ensayos de flujo lateral (LFA) para el dengue NS1 se utilizan de forma conocida en el ámbito clínico26,27. Sin embargo, la detección convencional de etiquetas LFA suele utilizarse a simple vista y solo proporciona resultados cualitativos.
En la última década, más de 5 mil millones de teléfonos inteligentes se han utilizado ampliamente en todo el mundo, y existe potencial para desarrollar la detección portátil28,29. Los teléfonos inteligentes tienen capacidades multifuncionales, como sensores físicos incorporados, procesadores multinúcleo, cámaras digitales, puertos USB, puertos de audio, software inalámbrico y de aplicaciones, lo que los hace adecuados para su uso en diversas plataformas de biosensores30. Además, las tecnologías inalámbricas permiten el envío rápido de datos y pueden utilizarse para la vigilancia in situ y en tiempo real31. Mudanyali et al. combinaron el inmunoensayo en papel y los teléfonos inteligentes para desarrollar una plataforma POCT portátil, sin equipos, rápida, de bajo costo y fácil de usar para la malaria, la tuberculosis y el VIH32. Ling et al. informaron de un ensayo de flujo lateral combinado con la cámara de un teléfono inteligente para detectar cuantitativamente la actividad de la fosfatasa alcalina en la leche33. Hou et al. también desarrollaron un sistema de imágenes de doble modalidad basado en teléfonos inteligentes para señales cuantitativas de color o fluorescencia en el ensayo de flujo lateral34. Además, el uso del teléfono inteligente como lector colorimétrico y cuantitativo puede mejorar la sensibilidad, mientras que a simple vista no se puede informar con seguridad de la presencia del objetivo35.
El DEN-NS1-PAD 36,37,38 (en adelante, el dispositivo) representa un gran avance en el diagnóstico del dengue y ofrece una solución portátil y eficiente. Utilizando tecnología basada en papel microfluídico impreso en cera, este dispositivo cuantifica NS1 con alta sensibilidad y especificidad a través del procesamiento de imágenes. Para mejorar aún más su utilidad, hemos desarrollado una aplicación para teléfonos inteligentes fácil de usar para la lectura colorimétrica y cuantitativa. La validación clínica utilizando muestras de pacientes de hospitales tailandeses subraya su impacto inmediato en la evaluación de pacientes en tiempo real. Nuestra innovación marca un avance fundamental en el manejo optimizado del dengue en el punto de atención, y promete revolucionar el diagnóstico en entornos de atención médica con recursos limitados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno de los parámetros de diseño importantes para un sistema de lectura basado en teléfonos inteligentes es la capacidad de proporcionar un procesamiento de imágenes reproducible de muestras. En este estudio, por simplicidad y conveniencia, las imágenes se capturaron desde tres marcas diferentes de teléfonos inteligentes con cámaras de 12-13 MP sin usar una caja de imágenes o accesorios. Las condiciones variables de captura de imágenes, como la resolución de la cámara, el tiempo de captura de imágenes, las con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.H.P. agradece el fondo de investigación de becas de la Universitas Islam Indonesia (UII). Los autores expresan su gratitud al Sr. Nutchanon Ninyawee por su valiosa experiencia y asistencia a lo largo del desarrollo de la aplicación móvil y sus contribuciones al manuscrito. Además, los autores agradecen el apoyo financiero brindado por Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Fondo de Investigación Básica: Año fiscal 2023 (proyecto no. FRB660073/0164) en el marco del Programa de Atención Sanitaria Inteligente de la Universidad Tecnológica Rey Mongkut de Thonburi.
Materials
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10×30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
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