Immunoassay נייד מבוסס נייר בשילוב עם יישום הטלפון החכם לזיהוי Colorimetric וכמותי של אנטיגן Dengue NS1
Summary
מענה לצרכים דחופים לאבחון דנגי, כאן אנו מציגים מכשיר אנליטי מבוסס נייר דנגי NS1 משולב באפליקציית סמארטפון (DEN-NS1-PAD) לכימות ריכוז האנטיגן של דנגי NS1 בדגימות סרום / דם קליניות. חדשנות זו משפרת את ניהול הדנגה על ידי סיוע בקבלת החלטות קליניות במסגרות בריאות שונות, אפילו מוגבלות במשאבים.
Abstract
זיהום בנגיף דנגי (DENV), המועבר על ידי יתושי אדס , הוא דאגה מרכזית לבריאות הציבור במדינות טרופיות וסובטרופיות. עם שכיחות שנתית של כ-10 מיליון מקרים ו-20,000-25,000 מקרי מוות, במיוחד בקרב ילדים, יש צורך דחוף בכלי אבחון מעשיים. נוכחותו של חלבון לא מבני של דנגי 1 (NS1) במהלך זיהום מוקדם נקשרה לשחרור ציטוקינים, דליפת כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל, מה שהופך אותו לסמן פוטנציאלי לדנגה חמורה.
בדיקות חיסוניות מבוססות נייר כגון מבחני זרימה לרוחב (LFAs) והתקנים אנליטיים מבוססי נייר מיקרופלואידים (PADs) צברו פופולריות כבדיקות אבחון בשל פשטותן, מהירותן, זולותן, ספציפיות וקלות הפרשנות שלהן. עם זאת, בדיקות חיסוניות קונבנציונליות מבוססות נייר לזיהוי דנגי NS1 מסתמכות בדרך כלל על בדיקה חזותית, ומניבות תוצאות איכותיות בלבד. כדי להתמודד עם מגבלה זו ולשפר את הרגישות, הצענו בדיקת זיהוי דנגי NS1 ניידת ביותר במכשיר אנליטי מבוסס נייר (PAD), כלומר, DEN-NS1-PAD, המשלב יישום סמארטפון כקורא צבעוני וכמותי. מערכת הפיתוח מאפשרת כימות ישיר של ריכוזי NS1 בדגימות קליניות.
דגימות סרום ודם שהתקבלו מחולים שימשו להדגמת ביצועי אב הטיפוס של המערכת. התוצאות התקבלו באופן מיידי וניתן להשתמש בהן להערכה קלינית, הן במתקני בריאות מאובזרים היטב והן במסגרות מוגבלות במשאבים. שילוב חדשני זה של בדיקה חיסונית מבוססת נייר עם יישום טלפון חכם מציע גישה מבטיחה לזיהוי וכימות משופרים של אנטיגן דנגי NS1. על ידי הגברת הרגישות מעבר ליכולות של עין בלתי, מערכת זו טומנת בחובה פוטנציאל גדול לשיפור קבלת ההחלטות הקליניות בניהול דנגי, במיוחד באזורים מרוחקים או מוחלשים.
Introduction
זיהום בנגיף דנגי (DENV) הוא המחלה המועברת על ידי יתושים המתפשטת במהירות הגבוהה ביותר1, ויותר מ -390 מיליון אנשים נגועים ב -96 מיליון זיהומים סימפטומטיים, 2 מיליון מקרים של מחלה קשה, ויותר מ -25,000 מקרי מוות בשנה מתרחשים בעולם 1,2. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -3.9 מיליארד אנשים נמצאים בסיכון לדנגה; ~70% חיים במדינות אסיה פסיפיק ובעיקר בדרום מזרח אסיה3. בשנת 2019, מספר מקרי הדנגה שדווחו לארגון הבריאות העולמי היה 4.2 מיליון, ותאילנד תרמה לפחות 136,000 מקרי דנגי ו -144 מקרי מוות מזיהום דנגי4. התפרצות הדנגה בתאילנד מתרחשת בעונה הגשומה, מאפריל עד דצמבר, באזורים עירוניים וכפריים כאחד, במיוחד באזור הצפון-מזרחי.
לזיהומים ב- DENV יש ביטויים קליניים שונים החל מתסמינים תת-קליניים, קדחת דנגי קלה (DF) ועד קדחת דימומית חמורה של דנגה (DHF). המאפיין העיקרי של מצב DHF חמור הוא חדירות כלי דם מוגברת ואחריה הלם ותפקוד לקוי של איברים1. הבנת המסלול המולקולרי שיכול לגרום לדליפת כלי הדם חשובה מאוד בפיתוח טיפולי דנגי יעילים. דנגי חלבון לא מבני 1 (NS1) הוא גליקופרוטאין מופרש במהלך זיהום מוקדםבנגיף 5,6, והוא מתפקד כקופקטור לשכפול RNA נגיפי7. NS1 יכול לגרום לשחרור ציטוקינים ולתרום לדליפה וסקולרית על ידי קשירה לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR4) וגליקוקליקסאנדותל 8,9. מחקרי מבחנה הראו כי NS1 מקיים אינטראקציה עם תאי אנדותל וגורם לאפופטוזיס. מצב זה יכול לתרום לתפקוד לקוי של האנדותל ולדליפת כלי דם10. רמות האנטיגן NS1, בקורלציה עם רמות אינטרלוקין בסרום (IL)-10, עלו באופן משמעותי בחולים עם מחלה קלינית קשה11. דנגי NS1 תורם גם לפתוגנזה של מחלות על ידי גרימת IL-10 ודיכוי תגובות תאי T ספציפיות ל- DENV12,13. בנוסף, חלבון דנגי NS1 היה קשור למחלה קלינית קשה, והריכוז של NS1 > 600 ng mL-1 בשלושת הימים הראשונים של המחלה היה קשור להתפתחות של DHF14.
ההתמדה של אנטיגן דנגי NS1 בחולים עם DHF יכול לשמש סמן של דנגיחמור 6. ישנן מספר שיטות לזיהוי NS1 בדגימות קליניות כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) והבדיקה המהירה15. תקן הזהב למדידת ריכוז חלבוני NS1 במסגרת קלינית הוא שיטת ELISA. עם זאת, שיטת ELISA היא יקרה ודורשת כוח אדם מיומן, ומתקני מעבדה16. לכן, פיתוח הטכנולוגיה לגילוי וכימות חלבוני NS1 במבחן נקודת הטיפול (POCT) עדיין נמשך. בעשור האחרון, בדיקות חיסוניות מבוססות נייר כגון מבחני זרימה צידית (LFAs) והתקנים אנליטיים מבוססי נייר מיקרופלואידים (μPADs) הפכו פופולריים כבדיקות אבחון בגלל הפשטות, המהירות, הזולות והספציפיות שלהם 17,18,19. במערכת חיסונית מבוססת נייר, מספר תוויות שימשו ליצירת אותות, כגון ננו-חלקיקי זהב (AuNPs)20, ננו-חלקיקים מגנטיים21,22, נקודות קוונטיות23 וחומרים פלואורסצנטיים24,25. AuNPs הן התוויות הנפוצות ביותר המשמשות בבדיקות חיסוניות מבוססות נייר בשל עלות הייצור הזולה שלהן, קלות הייצור, היציבות והקריאה הפשוטה שלהן. נכון לעכשיו, בדיקות זרימה לרוחב (LFAs) עבור דנגי NS1 משמשים המפורסם בסביבה הקלינית26,27. עם זאת, זיהוי תוויות LFA קונבנציונלי משתמש בדרך כלל בעין בלתי ומספק רק תוצאות איכותיות.
בעשור האחרון, יותר מ -5 מיליארד טלפונים חכמים היו בשימוש נרחב ברחבי העולם, ויש פוטנציאל לפיתוח זיהוי נייד28,29. לסמארטפונים יש יכולות רב-תכליתיות כגון חיישנים פיזיים מובנים, מעבדים מרובי ליבות, מצלמות דיגיטליות, יציאות USB, יציאות שמע, אלחוט ותוכנות יישומים, מה שהופך אותם למתאימים לשימוש בפלטפורמות ביו-חיישנים שונות30. בנוסף, טכנולוגיות אלחוטיות מאפשרות שליחת נתונים במהירות וניתן להשתמש בהן לניטור בזמן אמת ובאתר הלקוח31. Mudanyali et al. שילבו את החיסון מבוסס הנייר ואת הסמארטפונים כדי לפתח פלטפורמת POCT ניידת, ללא ציוד, מהירה, בעלות נמוכה וידידותית למשתמש עבור מלריה, שחפת ו- HIV32. לינג ועמיתיו דיווחו על בדיקת זרימה רוחבית בשילוב עם מצלמת סמארטפון כדי לזהות פעילות פוספטאז אלקליין בחלב באופן כמותי33. Hou et al. פיתחו גם מערכת הדמיה דו-מודאלית מבוססת סמארטפון עבור אותות כמותיים מצבע או פלואורסצנטיות בבדיקת הזרימה הצידית34. בנוסף, שימוש בסמארטפון כקורא קולורימטרי וכמותי יכול לשפר את הרגישות בעוד שהעין הבלתי אינה יכולה לדווח בביטחון על נוכחות המטרה35.
מציג פריצת דרך באבחון דנגי, DEN-NS1-PAD 36,37,38 (המכונה המכשיר להלן) מציע פתרון נייד ויעיל. באמצעות טכנולוגיה מבוססת נייר מיקרופלואידי המודפס בשעווה, התקן זה מכמת את NS1 עם רגישות גבוהה וספציפיות באמצעות עיבוד תמונה. כדי לשפר עוד יותר את השירות שלה, פיתחנו אפליקציית סמארטפון ידידותית למשתמש לקריאה צבעונית וכמותית. תיקוף קליני באמצעות דגימות מטופלים מבתי חולים תאילנדיים מדגיש את השפעתו המיידית על הערכת המטופלים בזמן אמת. החדשנות שלנו מסמנת התקדמות מרכזית בניהול יעיל של נקודות טיפול, ומבטיחה לחולל מהפכה בתחום האבחון בנופים של שירותי בריאות מוגבלים במשאבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד הפרמטרים החשובים לתכנון עבור מערכת קוראים מבוססת סמארטפון הוא היכולת לספק עיבוד הדמיה ניתן לשחזור של דגימות. במחקר זה, לשם פשטות ונוחות, התמונות צולמו משלושה מותגי סמארטפונים שונים עם מצלמות 12-13 מגה פיקסל ללא שימוש בקופסת הדמיה או אביזרים. תנאים משתנים של לכידת תמונה, כגון רזולוציית ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.H.P. מודה בהכרת תודה לקרן המחקר של Universitas Islam Indonesia (UII). המחברים מודים למר Nutchanon Ninyawee על מומחיותו רבת הערך וסיועו בפיתוח האפליקציה הניידת ותרומתו לכתב היד. יתר על כן, המחברים מעריכים את התמיכה הכספית הניתנת על ידי תאילנד מדע מחקר וחדשנות (TSRI), קרן מחקר בסיסית: שנת הכספים 2023 (פרויקט מס ‘. FRB660073/0164) במסגרת תוכנית בריאות חכמה של האוניברסיטה הטכנולוגית של המלך מונגקוט תונבורי.
Materials
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10×30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). . Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , 1-34 (2012).
- . WHO Dengue and severe dengue Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020)
- Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. . Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
- Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
- Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
- Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
- Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
- Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
- Lin, C. -. F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
- Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
- Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
- Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
- Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
- World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). . Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control — New edition. , (2009).
- Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
- Kim, S. -. W., Cho, I. -. H., Lim, G. -. S., Park, G. -. N., Paek, S. -. H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
- Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
- Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V. Immunochromatographic methods in food analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 55, 81-93 (2014).
- Hu, J., et al. Advances in paper-based point-of-care diagnostics. Biosensors and Bioelectronics. 54 (4), 585-597 (2014).
- Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
- Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
- Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
- He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
- Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
- Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
- Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
- Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D. Biosensing with cell phones. Trends in Biotechnology. 32 (7), 351-355 (2014).
- Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
- Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
- Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
- Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
- Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
- You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -. Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
- Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
- Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
- Prabowo, M. H., et al. Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. , (2019).
- Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
- Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
- Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
- Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
- Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
- Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
- Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
- Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
- Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
- Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
- Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
- Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
- Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
- Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
- Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
- Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
- Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
- Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
- Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).
